Експериментални модели остеоартритиса

Хрскавица је високо специјализовано ткиво које садржи само једну врсту ћелија (хондроците), које карактерише одсуство крви и лимфних судова. Исхрана хрскавице углавном се врши апсорпцијом из синовијалне течности. Метаболизам хондро-цитаса регулише се бројним растворљивим факторима који локално произведу хондроцити и околна ткива. Функција хондроцита такође зависи од састава екстрацелуларног медија (напетост кисеоника, концентрација јона, пХ, итд.), Састав ЕЦМ-а, интеракција ћелија и матрице и физички сигнали. Главни задатак експерименталног моделирања је стварање култура у ванћелијском окружењу без промјене фенотипа зреле ћелије. Други задатак је стварање култура за проучавање преураног, одложеног, кратког или дуготрајног одговора хондроцита на хемијске и / или физичке сигнале. Студије ин витро такође пружају прилику да студирају понашање хондроцита у остеоартритиса. Трећи задатак је развој ко-куративних система, који омогућавају проучавање интеракција различитих ткива у зглобу. Четврти задатак је припрема крвотворних имплантата за накнадну трансплантацију. И, коначно, пети задатак је проучавање фактора раста, цитокина или терапијских средстава који су способни да стимулишу поправку и / или инхибирају његову ресорпцију хрскавице.

Током протеклих деценија створени су различити модели култних ћелија крвних жлијезда, укључујући монолојне културе, суспендоване културе, кондоре хондрона, експлантати, коктури, бесмртне ћелијске културе. Свака култура има своје предности и недостатке и свака је погодна за проучавање једног посебног аспекта метаболизма хондроцита. Стога, хрскавице експлантати су одличан модел за проучавање обрта матричних елемената, што захтијева стварне рецепторе ћелијске површине и нормалне ћелијске матрице и интеракције матрице-ћелија. Истовремено, препоручује се проучавање депозита у матриксу или механизама за регулацију метаболизма хондроцита на култури изолованих ћелија. Моноларна култура ниске густине је неопходна за проучавање процеса диференцијације ћелија. Културе суспендоване у природној или синтетичкој матрици представљају модел за анализу адаптивног одговора хондроцита на механички стрес.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7]

Цхондроците цултурес

Приликом одабира ткива хрскавице за студије ин витро, потребно је размотрити неколико важних тачака. Матрични састав и метаболичка активност хондроцита варирају у различитим зглобовима, а други такође зависе од дубине хондроцита у ткиву. Ови подаци су добијени у неколико експеримената у којима су испитиване изоловане субпопулације хондроцита из зрна хрскавица различитих дубина. Пронађени су бројни морфолошки и биохемијски разлике између култивисаних хондроцита који се налазе на површини и дубоким слојевима артикулисане хрскавице. Површинске ћелије синтетишу ријетку, осиромашену фибрилирну матрицу протеогликана, док дубље ћелије производе матрицу која је богата фибрилима и протеогликанима. Осим тога, површинске ћелије производе релативно мање малих неагрегираних протеогликана и хијалуронске киселине и релативно мање агреганца и кератан сулфата од дубљих хондроцита. Још једна важна карактеристична метода метаболизма хондроцита изолованих из зрна хрскавица различитих дубина је одговор на егзогени стимулус. Према М. Аиделотте-у и коауторима, бикови хондроцити из површине зрна хрскавице били су осетљивији на ИЛ-1 у односу на ћелије дубоке зоне.

Понашање ћелија такође зависи од локације ткива. Хондроцити хрскавице и уши ивице, узете из истог животиње која реагују различито на факторе раста, као што је фактор раста фибробласта (ФГФ) и ТГФ-бета. ФГФ повећао је инкорпорирање тимидина, пролина и леуцина у културу хондроцита ребра, али не и ухо. ТГФ-П повећао инкорпорацију тимидина у хрскавице Хондроцити ребра и уха, али није утицао на тимидина у хондроцитима и пролина уво. Ћелије хрскавице које се добијају из зона са највећим оптерећењем разликују се од оних са локација са ниским оптерећењем хрскавице. На пример, зреле хондроцити на хрскавице зглоба колена од централног региона оваца зглобне тибијални кости површине нису покривени мениска, који носи највећи терет ин виво, мањем синтетизовани агрекан, децорин али је већа од ћелија областима обухваћеним мениска. Аутори такође наглашавају важност употребе хрскавице из идентичних заједничких зона приликом испитивања синтетичке функције зглобова.

Метаболизам хондроцита и њихов одговор на регулаторне факторе такође значајно зависи од старости донатора, развоја његовог скелета и стања зглобова из којих се узимају ћелије. У хуманим хондроцитима примећен је значајан пад са старошћу пролиферативног одговора. Највећи пад се примећује код донатора старих од 40 до 50 година и преко 60 година. Штавише, тежина пролиферативног одговора на факторе раста (нпр. ФГФ и ТГФ-бета) се смањује током старења. Поред квантитативних промјена у пролиферацији хондроцита, постоје и квалитативне промјене. Ћелије младих донора (10-20 година старости) боље реагују на фактор раста фактора раста од тромбоцита (ПДГФ) него на ТГФ-бета, док супротно се примећује код одраслих донорских ћелија. Да би се објасниле временске зависне промјене у синтетичкој функцији хондроцита и њихов одговор на ефекат фактора раста, кориштени су неколико механизама. Међу њима је смањење броја и афинитета површинских ћелијских рецептора, промена у синтези и биоактивност фактора раста и цитокина, модификација сигнала пострецептора.

Патолошко стање зглобова такође мења морфологију и метаболичку активност хондроцита. Дакле, Ј. Коури и коаутори (1996) су идентификовали три субпопулације хондроцита у хрскавици са остеоартритисом. Хондроцити из површне и горње средине хрскавице формирају кластере и синтетишу више протеогликана и колагена. ТГФ-бета, и инсулину сличан фактор раста (ИГФ) могу стимулисати протеогликана синтезу хондроцити и делимично неутралише ефекте ИЛ-1 и ТНФ-а. Хрскавице експланти су обузета остеоартритиса, а хондроцити изолованих из хрскавице пацијената са остеоартритиса су осетљивији на стимулацију ТГФ-бета од здравих хрскавице хондроцита. Ове разлике су највероватније повезане са фенотипским променама у хондроцитима у горњим слојевима зглобне хрскавице.

Изоловање појединачних хондроцита се постиже секвенцијалним третманом са протеолитичким ензимима ЕЦМ-а. Након њиховог ослобађања од ЕЦМ-а, изоловане ћелије су идеално погодне за проучавање синтезе компоненти де ново матрице . Неки аутори користе само клостридијум колагеназу, други пре-инкубирају хрскавицу с трипсином, пронасе, ДНасе и / или хијалуронидазом. Број изолованих ћелија зависи од коришћених ензима. Стога, приликом обраде једног од 1 г колагеназе ткива може се добити 1,4Т0 ⁶ Хондроцити, а када користите Пронасе, хиалуронидасе и колагеназе - 4,3-10 ⁶. Код обраде са коллагеназом, агрегрецаном, протеинима, ИЛ-6, ИЛ-8 остаје у култури ћелија много више него у случају секвенцијалног третмана са различитим ензима. Постоји неколико објашњења за ове разлике између две ћелијске културе:

• Целлулар рецептори оштећене или депресивни деловањем ензима, ТГФ-бета инхибира ДНК синтезу протеогликане у ново изолованим хондроцитима (даи 1), док је ДНК и протеогликана синтезу хондроцита култивисане у монослој (7 дана) стимулисаних помоћу ТГФ-бета. Међутим, да би се поново експекирале ове компоненте мембране, потребно је одговарајуће време пре почетка експеримента.
• Ексогене протеазе могу прекинути интеракцију ћелија и матрице, посредоване интегринима. Интегринска породица промовише везивање хондроцита на ВКМ молекуле (Схакибаеи М. И сар., 1997). Ова руптура може утицати на експресију матричних гена.
• Остаци матричних компоненти могу регулисати синтетичку функцију хондроцита. Интегрини су у стању препознати производе деградације ЕЦМ-а, чиме играју важну улогу у поправљању ткива након излагања протеолитичким ензимима. Т. Ларссон и коаутори (1989) су извијестили да додавање нетакнутих или фрагментираних про-теогликана у ћелијску културу стимулише синтезу протеина и протеогликана. Међутим, висок ниво хијалуронске киселине изазива значајно смањење укључивањем сулфата протеогликана синтезе Хондроцити ембриона пилета хондроцитима сазревају порцине и хондросарком пацов ћелије. Штавише, хијалуронска киселина - инхибитор протеогликана отпуштања из ћелија чак иу присуству ИЛ-лб, ТНФ-а, ФГФ, указујући да први супротстављају биолошку активност фактора раста и цитокина. Тачан механизам који лежи у делу хијалуронске киселине остаје нејасан; Познато је да хондроцити садрже рецептор за хијалуронску киселину, повезан са актином филаментима цитосола. Везивање хијалуронске киселине на његов рецептор стимулише фосфорилацију протеина. Према томе, ови подаци показују модулацију метаболичке функције хондроцита фрагментираним или природним молекулима протеина матрикса активирањем мембранских рецепторских ћелија.
• Брза стимулација ензима синтезе матрикс протеина хондроцитима може бити последица промене облика хондроцита и / или реорганизације цитоскелета.
• Неки цитокини (нпр. ИЛ-8) и фактори раста (нпр. ИГФ-1, ТГФ-П) су фиксирани у ЕЦМ-у. Најбољи пример је везивање ТГФ-бета са декором, што доводи до смањења способности првог да индукује раст ћелија у ћелијама јајника код кинеских хрчака. Податак да садржај укрштања хрскавице повећава са годинама, указује на смањење биорасположивости ТГФ-бета у старењу. Фактори раста и цитокини могу се ослободити из матричних остатака током културе, а затим модулирати функцију хондроцита.

[8], [9], [10], [11],

Монолојна култура хондроцита

Диференцирани фенотип хондроцита се првенствено карактерише синтезом колагена типа ИИ и протеогликана специфичних за ткиво, као и низак ниво митотске активности. Постоје докази да дугорочно гајења ћелија у једног слоја, и после неколико поновљених пролаза ћелија, хондроците губе сферни облик, постају издужено, фибробласта попут облика. Са таквим фибробласта метаплазијом синтетичка функција такође модификован ћелије, које карактеришу прогресивним смањењем у синтези колагена ИИ, ИКС и врсте КСИ и побољшану синтезу колагена И, ИИИ и Утипов. Мали неаггрегирани протеогликани се синтетишу функционалним аггрецаном. Синтхетзатепсин Б и Л су изузетно ниски у диференцираним ћелијама, али у процесу губитка диференцијације се повећава. Колагеназе-1 изражава у диференцираним хондроцитима током продуженог култивације његова експресија се смањује, док повећане продукције инхибитора ткива металопротеаза (ТИМП).

Диференцирани хондроцити поново изражавају колаген диференцираног фенотипа када се преносе из монолојне културе на суспендовану. Процес диференцирања вероватно је повезан са обликом ћелија. Ова имовина редовно користе истраживачи који проучавају неисправне трансплантате са аутологним хондроцитима. Мали број ћелија добивених из биопсијског материјала може се помножити у монолојној култури, а затим поново ставити у тродимензионалну матрицу пре трансплантације. Поновно експресија специфичних фенотипских дедифферентиатед хондроцитима мигрирали у агароза култури, може бити стимулисано ТГФ-п-Оссеин хидроксиапатита комплексне и аскорбинске киселине.

Као одговор на ефекат фактора раста и цитокина, хондроцити се модификују током процеса диференцијације. Ћелијски одговори на цитокине и факторе раста разликују се између недиференцираних и диференцираних хондроцита. ИЛ-1 стимулише пролиферацију фибробласта, док је раст недиференцираних хондроцита инхибиран ИЛ-1. Синтеза ДНК је стимулисана помоћу ИГФ-1 у издуженим, али не и равнима хондроцитима. У диференцираним хондроцитима, стимулативни ефекти ИЛ-1β и ТНФ-α на производе процоллагеназе су израженији него код недиференцираних.

Узгој хондроцита

Гајење хондроцита у суспензији у течном медију или у природној или синтетичкој тродимензионалној матрици стабилизује фенотип хондроцита. Ћелије задржавају свој сферни облик, синтетишу протеине специфичне за ткиво. Уобичајена култура хондроцита се обично препоручује за проучавање формирања нове периоцелуларне матрице. Кондроцентне културе у синтетичким или природним апсорбентним полимерима користе се за имплантацију ћелија у дефекте хрскавице ради стимулације регенерације ткива хрскавице у зглобу. Синтетичко или природно окружење за имплантабилне ћелије мора задовољити низ захтјева:

• Имплантати би требали имати порозну структуру за адхезију и раст ћелија,
• ни сам полимер ни производи његове деградације не би требало да проузрокују упале или токсичне реакције током ин виво имплантације ,
• носач трансплантата треба да се може везати за суседну хрскаву или субхондралну кост,
• природна или синтетичка матрица мора бити способна апсорпције, његова деградација мора бити уравнотежена регенерацијом ткива,
• Да би се олакшало поправљање хрскавице, хемијска структура и матрична архитектура матрице требало би да помогну одржавање ћелијског фенотипа кодираног хондроцитима и синтезом протеина специфичних за ткиво,
• током имплантације ин виво, потребно је проучити механичке особине синтетичке или природне матрице.

[12], [13], [14], [15], [16]

Суспензија хондроцита у течној фази

Целл везаност за пластичним бродовима, у којима је култивисања хондроцита може спречити своје зидове обложене раствором метил целулозу, агароза, хидрогелс (поли-2-хидроксиетилметакрилат) или смеше колагеном-агароза. Под овим условима, хондроцити формирају кластере и синтетизују углавном агреганске и ткивно специфичне колагене (ИИ, ИКС, КСИ типове). Обично су пронађене две врсте ћелија. Ћелије које се налазе у центру задржавају сферни облик окружен добро развијеним ЕЦМ-ом, што потврђују хистохемијске и ултраструктурне студије. На периферији хондроцити имају дискоидне контуре, окружени су ретким ЕЦМ-ом; Мало се зна о функционалним карактеристикама таквих ћелија.

Могућа је култивација хондроцита на микро носачима подупртим у суспензији; Дектран зрна (цитодек), декстранске перле, обложене колагеном (цитодекс ИИИ), неуправне микросфере колагена типа И (колаген) се користе као микроскопери. Под овим условима културе, хондроцити се причвршћују на површину микропроцесора, задржавају њихов сферни облик и производе матрични материјал. Штавише, употреба колагена промовише пролиферацију хондроцита и реекспрессију нормалног фенотипа. Због тога се култивација хондроцита на микросферама колагена може користити за обнову ћелијског фенотипа пре трансплантације.

Други метод култивисања Хондроцити суспендоване у течном медијуму је у облику њихових култивације густе перли који се састоји од ћелија (0.5-1 * 10 ^б ) добијен центрифугирањем. Такви хондроцити могу да произведу матрицу која садржи велики број протеогликана, колагена типа ИИ, али не и колагена типа И, што потврђују хистолошке, имунохистокемијске и квантитативне методе.

Суспензија хондроцита у природном ЕЦМ

Хондроцити може бити култивисан у суспензији у тродимензионални матрикса (меком агару, агароза, позовите гени гел или сунђер, хијалуронска киселина, фибрин лепак, алгината перле).

Културни агарозни хондроцити задржавају свој нормалан фенотип и синтетишу колагене типа ИИ и агрегате специфичне за ткиво. Када се култивишу у агарози, протеогликани синтетизовани у ћелији се у медијуму пуштају у току 50 дана. За упоређивање - у монолојној култури ћелијска фаза прелива се са гликозаминогликанима већ у првих 5-6 дана гајења; када се култивише у медијуму након интензификације синтезе и отпуштања гликозаминогликана, временски зависно смањење гликозаминогликана се јавља у првих 8-10 дана. Ипак, понашање хондроцита током њиховог узгоја у агарози се разликује од оног у условима ин виво. У агарози велики број синтетизованих Аггреган агрегата садржи мање и мање молекуле него ин виво. ТГФ-П стимулише синтезу протеогликана у експланту, али смањује синтезу аггрецана у агарози.

Алгинат је линеарни полисахарид изведен из смеђе морске алге. У присуству двовалентних катјона, као што су Ца ^{2+ јони}, овај полимер постаје гел. Сваки хондроцита ухваћен у алгината, окружен матрицом негативно наелектрисаних полисахарида, поре које су упоредиве са онима хијалина хрскавице. Матрица која је формирана Хондроцити у алгинат перлама, састоји се од два сегмента - танки слој ћелијски асоцираном матрице који одговарају перицеллулар и територијалних матрице зглобне хрскавице и удаљенијим матрице интертериторијалну еквивалентом на матерњем ткиву. 30. Дан културе, релативна и апсолутна запремина коју заузима ћелије, а сваки од два одељења у алгинат перле је скоро потпуно идентичан онима нативног хрскавице. За скоро 30 дана хондроцити задржавају свој облик сфере и производи агрекан, хидродинамичке особине које су сличне онима агрекан молекула у матрицу зглобне хрскавице и колагена молекула ИИ, ИКС и КСИ типова. У исто време, као другим културама, суспензије, алгината беадс на површини згњечити ћелије су присутне да генеришу мању количину тип И колагена молекуле, објављен директно у животну средину и није укључена у видеу. У алгинатним перлама примећује се умерена пролиферација хондроцита. После 8 месеци култивације у алгинат гел зрели хондроцитима не губи метаболичку активност и наставља да синтетише ткива специфична колагена типа ИИ и агрекан.

Н. Танака и коаутори (1984) истраживали су дифузионе особине различитих природних молекула у алгинату и открили да молекули већи од 70 кД не дифузују кроз алгинат. Тако је култивација ћелија у алгинату погодна за проучавање регулације матичне биосинтезе и организације ЕЦМ-а. Доступност ћелија култивисаних у алгинату омогућава истраживање ефеката регулаторних фактора пептида и фармаколошких агенаса на транскрипцијским, посттрансцриптионалним и транслационим нивоима.

Хондроцити су такође култивисани у матрици врста И и ИИ колагенских влакана. С. Нехрер ет ал (1997) поредили операција у паса хондроцита протеогликана осим Колаген-полимерна матрица садржи колагене различитих типова. Утврдили су важне разлике у морфологији биосинтетске функције хондроцита култивисаних у колагенским матрицама које садрже колагене типа И и ИИ. Ћелије у матриксу колагена типа ИИ навијале су њихов сферни облик, док су код колагена типа И имале морфологију сличну фибробласту. Штавише, у матрици колагена типа ИИ, хондроцити су произвели више гликозаминогликана. Ј. Ван Сусанте ет ал (1995) упоређују особине хондроцита култивисаних у алгинату и гелу колагена (тип И). Аутори нашли значајно повећање броја ћелија колагена гела, већ 6. Дан култивације ћелије изгубили карактеристичну фенотип, претворила у фибробласта налик ћелијама. У алгинатном гелу је забележено смањење броја ћелија, али хондроцити су задржали свој нормалан фенотип. Количина колагена гела протеогликане по ћелији биле су значајно више него у алгината, али пад је примећен у синтези гел матрикс елемената почевши од 6. Дана култивације, док у алгинат синтези наставља да расте.

Чврста тродимензионална фибринска матрица је природна супстанца која подржава хондроците који су у њему садржани у диференцираном фенотипу. 3Д фибрин матрица се такође може користити као носилац за трансплантацију хондроцита. Предности фибрина су одсуство цитотоксичности, способност попуњавања простора, способност лепљења. Би хистолошким и биохемијским студијама Ауторен-диографии, електронска микроскопија је показала да су хондроцити у фибрин гелу задржавају своју морфологију, умножавају и производе матрицу и након 2 недеље култивације. Међутим, Г. Хомминга ет ал (1993) известио да после 3 дана у култури, почиње распад фибрина напредује дедиференцијација хондроцита.

Суспензија хондроцита у вештачком (синтетичком) ЕЦМ

Хируршки имплантати за реконструктивну или ортопедску хирургију могу се добити растућим изолованим хондроцитима ин витро у синтетичкој биокомпатибилној матрици.

Културни хондроцити полигликолне киселине пролиферишу и одржавају нормалне морфологије и фенотип у року од 8 недеља. Комплекс хондроцита-полигликолне киселине састоји се од ћелија, гликозаминогликана, колагена и има спољну колагенску капсулу. Међутим, у таквим имплантатима постоје два типа молекула колагена - И и ИИ. Импланти за дедифферентиатед Хондроцити серије пролаза имају већу количину гликозамингликана и колаген него у имплантата у недиференциране примарних хондроцита.

Л. Фреед ет ал (1 993б) упоредио понашање хондроцита култура хуманог и говеда у влакнасте полигликолна киселина (ЕКАП) иу неслога полилактиловои киселини (ППЛЦ). После 6-8 недеља култивације бик хондроцита у ХСВГ или ППЛЦ, аутори су посматрали пролиферацију ћелија и регенерацију матрице хрскавице. У ХСБЦ-у, хондроцити су били сферични, смештени у лацунае окруженим мастилагинозним матриксом. После 8 недеља културе ин витро, регенерисано ткиво је садржало до 50% суве материје (4% ћелије, 15% гликозаминогликана и 31% колагена). У ППЛК ћелијама било је вретено, мала количина гликозаминогликана и колагена. У ХСБЦ-у је раст ћелија био 2 пута више интензиван него код ПТЦА. У условима ин виво, хондроцити узгајани у ХПВЦ и ППЛЦ током 1 до 6 месеци произвели су ткиво хистолошки слично хрустанчу. Имплантата садржавала су колаген глицосаминоглицанс, типа И и типа ИИ.

Хондроцити бета фетуса су култивисани у порозном хидрофобном и хидрофилном полиетилену високе густине. После 7 дана инкубације у оба супстрата, ћелије су задржале сферни облик, углавном са колагеном типа ИИ. Након 21 дана гајења, показало се да хидрофилна матрица садржи више колагена типа ИИ од хидрофобне матрице.

Ткиво хрскавице такође се може добити култивацијом у монолаиеру на Миллицелл-ЦМ филтерима. Пред-премазивање филтера са колагеном је неопходно за причвршћивање хондроита. Хистолошки преглед културе показује акумулацију хондроцита у ЕЦМ који садрже протеогликане и колагене типа ИИ. Колаген тип И у таквој култури није детектован. Хондроцити у резултујућем хрскавичном ткиву имају сферичну форму, али су на површини ткива донекле равнице. Дебљина новоформираног ткива повећала се с временом и зависила од иницијалне густине монолаиера ћелија. У оптималним условима културе, дебљина хрскавог ткива достигла је 110 μм, а организација његових ћелија и колагена на површини и дубоким слојевима је слична оној код артикулисане хрскавице. ВКМ садржи приближно 3 пута више колагена и протеогликана. После 2 недеље гајења, примећена је акумулација матрице-са, што је омогућило да се ткиво извуче из филтера и да се користи за трансплантацију.

Симс и сар. (1996) су проучавали култивацију хондроцита у полимерном матриксу са полиетилен оксидом и гелом, који дозвољава да се велики број ћелија транспортује ињектирањем. Шест недеља након ињекције у субкутано ткиво атхимских мишева формирана је нова хрскавица, која је морфолошки карактерисала бела опалесценција слична хијалној хрскавици. Подаци из хистолошких и биохемијских студија указују на присуство активно пролиферирајућих хондроцита, који производе ЕЦМ.

Експлантација

Испитивање хрскавог ткива се користи за проучавање процеса ана- и катаболизма у њему, хомеостазе, ресорпције и поправке. Цхондроцитес ин екплантс оф тхе цартилагиноус тиссуе суппорт тхе нормал пхенотипе анд цомпоситион оф ЕЦМ, симилар то тхосе ин артицулар цартилаге ин виво. После 5 дана гајења у присуству серума постиже се константни ниво синтезе и природне деградације. Ресорпција може убрзати културу ткива и у главном културе са додатком серума користећи број агената, на пример, ИЛ-ИБ, ТНФ-а, бактериалнихлипополисахаридов, деривати ретиноичном киселина или активним радикала кисеоника. Да би се испитала поправка хрскавице, оштећење је изазвано растворним медијаторима упале (Х ₂ О ₂, ИЛ-1, ТНФ-а) или физичким руптуре матрице.

Метода органотипских култура је модел за проучавање ин витро ефеката изолованих спољних фактора на хондроците и околну матрицу. Ин виво, хондроцити ретко се налазе у ЕЦМ-у и не контактирају једни друге. Култура експерименталне зглобне хрскавице задржава ову структурну организацију, као и специфичне интеракције између хондроцита и њиховог околишног екстрацелуларног окружења. Овај модел се такође користи за проучавање утицаја механичког стреса, фармаколошких агенаса, фактора раста, цитокина, хормона на метаболизам хрскавице.

Још једна предност објашњења хрскавог ткива је одсуство оштећења хондроцита од стране протеолитичких ензима или механичког фактора, што је неизбежно када се ћелије изолују. Рецептори и остали мембрански протеини и гликопротеини заштићени су од штетних фактора.

[17], [18], [19], [20], [21]

Култура хондрона

Хондрон - структуралних, функционално и метаболичка зглобне хрскавице јединица коју чине хондроцита перицеллулар матрикса и својом компактном филамената капсуле и одговоран је за хомеостазу матрице. Хондроне се механички извлаче из хрскавице и сакупљају се уз неколико узастопних хомогенизација у ниским брзинама. Изолована од зона различитим дубинама хондрони хрскавице се могу поделити у четири категорије: Појединачне хондрон, твин хондрони, мултипли (три или више) линеарно уређен хондрони (колона хондронов) хондронов загушењима.

Појединачни хондрони се обично налазе у средњим слојевима нетакнуте хрскавице, упарене - на граници средње и дубоких слојева, линеарно лоциране вишеструке хондроне типичне су за дубоке слојеве интактне хрскавице. На крају, кластери хондрона састоје се од насумично организованих група појединачних и упарених хондрона који задржавају агрегирано стање након хомогенизације. Акумулације хондрона су велики фрагменти хрскавице, који обично садрже неколико хондрона и радијално лоцираних колагенских фибрила, тј. Типична организација која је карактеристична за дубоке слојеве матрице. Цхондрони су имобилисани у провидној агарози, што омогућава проучавање њихове структуре, молекуларног састава и метаболичке активности. Хондрон систем - агароза сматра микро модел хрскавице, који се разликује од традиционалног система хондроцита - агароза који чува природну микроокружења, нема потребе да спроведе његову синтезу и монтажу. Култура хондрона је модел за проучавање интеракција ћелија и матрице у зглобној хрскавици у нормалним и патолошким условима.

[22], [23], [24], [25], [26], [27]

Култура бесмртних хондроцита

Да би створили сталне ћелијске линије, користе се рекомбинантне ДНК или онкоген који садрже вирусе који могу ћелију направити "бесмртним". Бесмртни хондроцити имају могућност бесконачне пролиферације, одржавајући стабилан фенотип. Ф. Маллеин-Герин и сарадници (1995) су показали да је онкогена је СВ40Т индукована пролиферација мишјих хондроцитима којих тако наставити да стабилно експримирају колагена ИИ, ИКС и КСИ врста, као заједничку и агрекан везујући протеин. Међутим, таква ћелијска линија стиче способност синтетизовања колагена типа И када се култивише у монолојној култури или у агарозном гелу.

В. Хортон и коаутори (1988) описали су линију бесмртних ћелија са ниским нивоом експресије мРНК типа ИИ колагена. Ове ћелије су добијене трансформацијом са ретровирусом миша који садржи И-миц- и и-ра-онкогене. Ова врста ћелија је јединствени модел за проучавање интеракција артикуларне матрице у одсуству колагена типа ИИ, као и регулисање синтезе колагена типа ИИ.

Култура хондропита са мутираним или избрисаним геном је згодан модел за проучавање њихове физиолошке функције. Овај модел је посебно погодан за проучавање улоге специфичних молекула у хрскавице матрикс организација или проучавају ефекте различитих регулаторних фактора на хрскавице метаболизам. Хондроцити ремоте гена синтетисано тип колагена ИКС колагена влакна шира од нормалног, указује тај тип колагена ИКС регулише пречник фибриле. Као што сам приметио у Поглављу 1, за новоутемељену мутације ЦОЛАИ типа енцодинг ИИ колагена у породицама са основним генерализоване остеоартритиса. Да би се испитао ефекат мутаната колагена тип ИИ у зглобне матрици Р. Дхармрварам ет ал (1997) обавља трансфекцију ( "контаминација" страно нуклеинске киселине) дефектан ЦОЛ ₂ АИ (аргинина на положају 519 замењује цистеин) у хуманих феталних хондроцитима ин витро.

Систем коктура. У зглобу, хрскавица ступа у интеракцију са ћелијама других врста садржаних у синовијалној мембрани, синовијалној течности, лигамената, субхондралне кости. На метаболизам хондроцита могу утицати различити растворљиви фактори синтетисани од стране ових ћелија. Дакле, артикуларни хрскавице артритиса уништавају протеолитички ензими и слободни радикали, који се производе од синовијалних ћелија. Због тога су развијени модели за проучавање сложених интеракција између хрскавице и околних ткива, које се називају кокултуре.

С. Лацомбе-Глеисе ет ал (1995) су култивисане раббит хондроцити и остеобласта у цоцултуре систему (Цостар), у којима су ћелије одвојене микропорозних мембрану (0,4 микрона) омогућава размену између два типа ћелија без икаквог директног контакта. Ова студија показала је способност остеобласта да стимулишу раст хондроцита кроз растворљиве медијаторе.

А.М. Малфаит и коаутори (1994) истраживали су однос између моноцита периферне крви и хондроцита. Овај модел је погодан за проучавање процеса посредованих цитокинима, код запаљенских артропатија (реуматоидни артритис, серонегативни спондилитис, итд.). Аутори овог модела раздвојили су ћелије мембраном која се везује за протеине са пречником од 0.4 μм. Студија је показала да липополисахардиу-стимулисан моноцити разрађен иФНО ИЛ-1-а, који инхибира синтезу хондроцитима агрекан и допринела деградацији већ синтетизованих агрекан агрегата.

К. Тада ет ал (1994) створио модел цоцултуре у којој су ставља ендотелне ћелије у колагеном (И типа) гел у унутрашњи комору из спољашњег коморе од којег га хондроцитима стављени у филтер са величином пора од 0.4 микрона. У стању потпуне изолације од спољне коморе, хумане ендотелне ћелије формирале су цеви у колагенском гелу у присуству ЕГФ или ТГФ-а. Са истовременом култивацијом оба типа ТГФ ћелија инхибирана је зависна формација епрувета ендотелним ћелијама. Инхибиција хондроцита овог процеса делимично је елиминисана анти-ТГФ-бета антителима. Може се претпоставити да ТГФ-бета, произведена од стране хондроцита, депресира васкуларизацију самог хрскавице.

С. Гроот и коаутори (1994) су истовремено култивисали хондроците из хипертрофних и пролиферативних зона кости 16-даног феталног миша са комадима мозга ткива. После 4 дана културе, примећено је трансдиференцирање хондроцита у остеобласте и почетак формирања остеоида. После 11 дана гајења, део хрскавице је замењен коштаним ткивом, а костна матрица је делимично калцификована. Неки неуропептиди и неуротрансмитери који производе мождано ткиво, утичу на метаболизам остеобласта или имају рецепторе на њима. Међу њима, може се изоловати норепинефрин, вазоактивни интестинални пептид, пептид повезан са калцитонин геном, супстанца П и соматостатин. У култури са хондроцитима, делови можданих ткива могу произвести неке од ових фактора, што може изазвати процес трансдиференцирања хондроцита у остеобласте.

[28], [29], [30], [31], [32], [33]

Утицај спољашњих фактора на културу хондроцита

Ефекат напетости кисеоника на метаболизам хондроцита

У већини случајева, култура хондроцита се развија у условима атмосферског напона кисеоника. Ипак, добро је познато да ин виво хондроцити постоје под хипоксичним условима и тензија кисеоника варира са различитим патолошким условима. Током процеса сазревања примећују се значајне промене у снабдевању крвљу епифиза. Пошто се васкуларизација разликује у различитим подручјима плоче за раст, тензија кисеоника у њима такође варира. Ц. Бригхтон и Р. Хеппенсталл (1971) показали су да је на плочи тибије код зечева тензид кисеоника у хипертрофичној зони мањи него у околним хрскавицама. Мерења неких метаболичких параметара показала су да хондроцити могу брзо реаговати на локалне промене у концентрацији кисеоника. Пре свега, са ниском напетошћу кисеоника, смањује се потрошња хондроцита. Са смањењем напетости кисеоника са 21 на 0,04%, повећава се употреба глукозе, активност ензима гликолизе и синтеза млечне киселине су повећани. Чак и са ниском напетошћу кисеоника, апсолутна количина АТП, АДП и АМП остаје стабилна. Ови подаци указују на усмереност метаболизма хондроцита ради максимизирања конзервације енергије. Ипак, синтетичка активност, а тиме и процеси репарације, мења се у условима хипоксије.

Висока напетост кисеоника такође утиче на метаболизам хондроцита, што доводи до смањења синтезе протеогликана и ДНК, деградације матрице хрскавице. Ови ефекти, по правилу, праћени су производњом слободних кисеоничких радикала.

Утицај концентрације јона и осмотског притиска околине на функцију хондроцита

У нативној концентрацији хрскавица јона значајно другачији од других ткива: Садржај натријума у екстрацелуларног медијума 250 - 350 ммол, а њен осмоламост - 350-450 мОсм. Када изоловање Хондроцити са видеорекордера и њихово инкубирањем у стандардном медијуму (ДМЕМ (Дулбеццо Минимал Ессентиал Медиум - Дулбеццо Минимум Ессентиал средња) осмоламости - 250-280,7 мОсм) мења нагло околну средину ћелије. Осим тога, концентрација калцијума и калијума у стандардним медијима је знатно нижа него код матерњег ткива, а концентрација ањона је много већа.

Додавање сахарозе у медијум доводи до повећања осмоларности и доводи до пролазног интрацелуларног повећања концентрације Х ⁺ и антитела калцијума у цитосолу. Такве интрацелуларне промене могу утицати на процесе диференцијације хондроцита и њихове метаболичке активности. Ј. Урбан ет ал (1993) је утврдио да укључивање ³⁵ 8-сулфата и ³ Х-пролин изолованих хондроцитима инкубирани у ДМЕМ стандардни медијум за 2-4 сати, износио је само 10% од тога у нативној ткиву. Синтеза интензитет достигла када осмоларност екстрацелуларног медију 350-400 мОсм у ново изолованих хондроцитима и хрскавицу експлантатана у. Штавише, запремина хондроцита повећана је за 30-40% након постављања изолованих ћелија у стандардном ДМЕМ медијуму поменуте осмоларности. Међутим, када се гаје Хондроцити под нон-физиолошке осмоларности за 12-16 сати, ћелије прилагођене новој средини смањењем интензитета смицање је пропорционална биосинтеза осмоларитет екстрацелуларног медијума.

П. Боргетти ет ал (1995) испитивали су ефекат осмоларности екстрацелуларног медијума на раст, морфологије и биосинтезу свињских хондроцита. Аутори показала сличне биохемијске и морфолошке карактеристике хондроцитима култивисане у медијуму са осмоларности мОсм 0.28 и 0.38. Када 0,48 мОсм осмоларитет медијума током првих 4-6 сати културе је примећено смањење ћелијске пролиферације и синтезу протеина, али касније дошло вратите ове параметре који коначно постигнут вредности контроле. Када култивисање Хондроцити у медијуму са 0,58 мОсм осмоламост ћелија губе способност да подрже физиолошког интензитета пролиферативни процеси након 6 дана број хондроцитима је значајно смањен. Са осмоларношћу медија, 0,58 мосмола, примећује се дубока инхибиција синтезе протеина. Поред тога, када се гаје у медијима са осмоларности мОсм 0,28-0,38 хондроцити задржава физиолошке фенотип на вишем осмоларности (мОсм 0,48-0,58) значајне промене у ћелијској морфологији, израженог губитка карактеристика фенотип Хондроцити конверзију у фибробласту сличне ћелије, као и губитак ћелија, способност састављања протеогликана матрикса. Резултати ове студије показују способност хондроцита да реагују на ограничене осцилације осмолитета у екстрацелуларном окружењу.

Промена концентрације других јона такође може утицати на процесе биосинтезе код хондроцита. Стога, степен инклузије ³⁵ С (сулфата) повећава се за пола повећањем концентрације калијумових јона од 5 ммол (концентрација у стандардном ДМ ДМ медијуму) до 10 ммол (концентрација у ВКМ ин виво). Калцијум концентрације испод 0,5 ммол повећаном продукцијом колагена зрелим говеда хондроцитима, док концентрација 1-2 мМ (одговара концентрацији у стандардном окружењу ДМ ЕМ) изазвао значајно смањење синтезе колагена. Умерено повећање биосинтезе примећено је код високих нивоа калцијума (2-10 ммол). Различити катиони учествују у везивању хондроцита до ВКМ протеина. Тако магнезијум и мангански јони обезбеђују везу са фибронектином и колагеном типа ИИ, док калцијумови иони не учествују у везивању хондроцита са протеинима. Стога, резултати студија описаних показују ефекат промена екстрацелуларног калијума јона, натријум, калцијум и осмоларитет медијума за хондроцита функције биосинтезе инкубиране у стандардној медијима.

Утицај механичког стреса на метаболизам хондроцита

Имобилизација зглоба узрокује реверзибилну атрофију хрскавице, што указује на потребу механичких стимуланса за нормалан ток метаболичких процеса у ЕЦМ-у. У већини случајева, модели који се користе у култури ћелија постоје у условима нормалног атмосферског притиска. М. Вригхт и коаутори (1996) су показали да механичко окружење утиче на метаболизам хондроцита, одговор ћелија зависи од интензитета и фреквенције оптерећења компресије. Експерименти са оптерећењем на нетакнутих експлантата зглобне хрскавице ин витро показала смањење синтезе протеина и протеогликане под статичким оптерећењем, динамичко оптерећење а стимулишу ове процесе. Јасни механизми за спровођење ефеката механичког оптерећења на хрскавице комплекса и вероватно повезано са соја ћелија, хидростатичког притиска осмотског притиска, електрични потенцијал и ћелијским површинским рецепторима за молекуле матрикса. Да бисте проучили ефекат сваког од ових параметара, неопходно је направити систем у којем један параметар може бити независно разноврстан. На пример, експлантна култура није погодна за проучавање ћелијске деформације, али се може користити за проучавање укупног ефекта притиска на метаболичку активност хондроцита. Компресија хрскавице доводи до ћелијске деформација, као и пратњи појаве хидростатичког градијента притиска, електричног потенцијала и течности протока промена физичко факторе попут садржаја воде у матрици, густине наелектрисања, ниво осмотског притиска. Деформације ћелија се могу проучавати коришћењем изолованих хондроцита уроњених у агарозни или колагенски гел.

Развијен је неколико система за проучавање утицаја механичке стимулације на културу хондроцита. Неки истраживачи користе системе за ову сврху у којима се притисак примењује на ћелијску културу кроз гасну фазу. На пример, ЈП Велдхуијзен ет ал (1979) користећи притисак изнад атмосферског од 13 кПа на ниске фреквенције (0,3 Хз) током 15 минута, примећено повећање у синтези цАМП и протеогликане и спуштање синтезу ДНК. Р. Смитх ет ал (1996) су показали да је испрекидано излагање примарних култура хондроцити бикова хидростатичког притиска (10 МПа) на 1 Хз током 4 сата изазвала повећање синтезе агрекан и колагена тип ИИ, док је стални притисак нема ефекта на ове процесе. Користећи сличан систем М. Вригхт ет ал (1996) известила да циклично притисак на култури ћелија је повезан са хиперполаризатион ћелијске мембране хондроцита и активирања Ца ²⁺ -зависни калијум канала. Стога, ефекти цикличног притиска посредују јонским каналима, активираним истезањем, у хондроцитној мембрани. Одзив хондроцита на хидростатички притисак зависи од услова ћелијске културе и учесталости примењеног оптерећења. Стога, циклични хидростатички притисак (5 МПа) смањује инкорпорацију сулфата у хондроцита монослоја на фреквенцији од 0,05, 0,25 и 0,5 Хз, а за фреквенције изнад 0.5 Хз инклузије сулфата у хрскавицу експлант повећава.

Бусхманн М. Ет ал (1992) известили да хондроцити у агароза гела Мр. Мењају биосинтезу као одговор на статичких и динамичких механичког оптерећења, као култивисан нетакнутом орган. Аутори су открили да механичко оптерећење генерише хиперосмотички стимулус праћен смањењем пХ у хондроцитима.

Ефекат механичког истезања може се проучити на култури ћелија уроњених у гел. Сила истезања се може направити помоћу рачунарског контролисаног вакуума. Када је систем у одређеном степену вакуумом, доњи део Петри шољи са културом ћелија је проширен познатом количином, максимално деформације на ивицама дна чаше и минимум у центру. Истезање се преноси и култивише у петријевом јарку хондроцита. Овим поступком Холм-Валл К. Ет ал (1995) показују да култивисане колагеном (ИИ типе) гел хондросарком ћелија повећава експресију иРНК и _2. -интегрина. И ₂ п _г интегрин се може везати за колаген типа ИИ. Сматра се да је механизаморецептор, пошто интерагује са протеином који везује актин, чиме се повезује ЕЦМ и цитоскелет.

Утицај пХ на метаболизам хондроцита

ПХ интерстицијалне течности ЕЦМ кртагиног ткива је киселији него у другим ткивима. А. Мароудас (1980) је одредио пХ артикуларне хрскавице на 6.9. В. Диамант и коаутори (1966) су пронашли пХ од 5,5 у патолошким условима. Познато је да живим хондроцитима при ниској ПО2, указују на кључну улогу гликолизе (95% укупан метаболизам глукозе) у метаболизму ових ћелија; гликолиза прати производњу велике количине млечне киселине.

Поред ацидификације животне средине производа гликолизе, саме матричне компоненте су од велике важности. Велики број фиксне негативним наелектрисањем на екстрацелуларне протеогликане мења јонски састав: постоји висока концентрација слободних катјона (нпр Х ⁺, На ⁺, К ⁺ ) и ниске концентрације ањона (нпр О2, НПХС). Поред тога, под утицајем механичког оптерећења, вода се протјерава из ЕЦМ-а, што доводи до повећања концентрације фиксних негативних утицаја и привлачења више кација на матрицу. Ово је праћено смањењем пХ екстрацелуларног медија, који утиче на интрацелуларни пХ, чиме се модификује метаболизам хондроцита. Р. Вилкин анд А. Халл (1995) проучавао ефекат пХ екстрацелуларног и интрацелуларног матрикса окружење биосинтезе изолованих говеда хондроцита. Они су посматрали двоструку модификацију синтезе матрица са смањењем пХ вредности. Благи пад пХ (7.4 <пХ <7,1) на50% повећао инкорпорацију ³⁵ С0 ₄ и ³ Х-пролина у хондроцитима, док дубље закисељавање (пХ <7,1) инхибира синтезу за 75% у поређењу са контрола. Стварање истог ниског пХ (6,65) са амонијумским јонима изазвало је смањење синтезе матрице за само 20%. Добијени резултати указују на то да модификација пХ екстрацелуларне матрице синтезе не може се објаснити само променама у пХ интрацелуларног медија. Надаље, хондроцити поседују способност да регулише интрацелуларни пХ за На ⁺, Х ⁺ измењивача, Ца ⁺ -зависни Ц1 ^_ -НСОЗ -ЦОНВЕИОРС и Х ⁺ / АТПазе.

[34], [35], [36], [37], [38], [39], [40]

Ефекат састава медија за култивацију на метаболизам хондроцита

Средство за култивацију хондроцита мора одговарати експерименталним условима. Последњих година, серум за теле се користи за оптимизацију услова културе. Међутим, када се користи серум, потребно је размотрити неколико важних тачака:

• спољни раст ћелија са периферије ткива у органским културама,
• варијабилност састава серума различитих серија,
• присуство непознатих компоненти у њима,
• повећан ризик од сметњи, артефакте у истраживању утицаја различитих биолошких фактора на метаболичку активност ћелија.

Пример другог је проучавање ефекта ЕГФ-а на хондроците хрскавице код пацова. ЕГФ је стимулисао инкорпорирање ³ Х-тимидина и повећање садржаја ДНК у култури. Овај ефекат је био изражен при ниским серумским концентрацијама (<1%), али у високим концентрацијама (> 7,5%) ефекат је нестао.

Познато је да су нивои синтезе и деградације у ДМЕМ обогаћени серумом теле значајно повећани у поређењу са ин виво условима. Разлике између метаболизма ин виво и ин витро могу бити узроковане разликама између синовијалне течности и околине у којој су ћелије култивисане. Д. Лее ет ал (1997) су култивисане Хондроцити младих бикова агароза користећи хранљиве подлоге садржи ДМЕМ, обогаћену са 20% телећег серума и великог броја алогене нормалне синовијској течности. Присуство синовијалне течности у медију изазвало је повећање броја протеогликана, до 80% укупне количине синовијалне течности. Ови резултати указују да синовиал флуид у култури индукује метаболизма, сличан оном који ин виво, са високим нивоом синтезе глукозаминогликана и ниског нивоа деобе ћелија.

Г. Вербругген ет ал (1995) су показали да је синтеза ³⁵ С-аррпеКаХа људских Хондроцити култивисане у агароза у ДМЕМ без серума је 20-30% од нивоа синтезе посматраних у ДМЕМ, са додатком 10% серума телета. Аутори одредити обим у којем ИГФ-1, ИГФ-2, ТГФ-П или смањује производњу инсулина агрекан у подлози без серума. Закључили аутори да 100 нг / мл инсулина, ИГФ-1 или ИГФ-2 делимично смањено синтеза агрекан до 39-53% од нивоа контроле. Са комбинацијом ових фактора, нису идентификовани синергијски или кумулативни појави. Истовремено, 10 нг / мл ТГФ-П у присуству 100 нг / мл инсулина стимулисана синтезу агрекан до 90% или више референтне нивоа. На крају, серумски трансферрин, сам или у комбинацији са инсулином, није утицао на синтезу аггрецана. Када је серум од тела замењен говеђим серумским албумином, агрегатни садржај аггрецана је значајно смањен. Обогаћивање медијум културе са инсулином, ИГФ или ТГФ-П је делимично обновљена способност ћелија да производе агрекан агрегате. У овом случају, ИГФ-1 и инсулин су способни да одржавају хомеостазу у ћелијским културама. После 40 дана културе у медијуму са додатком 10-20 нг / мл ИГФ-1, протеогликана синтеза је одржавана на истом нивоу или чак већи у поређењу са медијум који садржи 20% телећи серум. Катаболицке процеси опасности: Суђења медијуму обогаћеном са ИГФ-1 у односу на медијуму са 0,1% раствору албумина, али донекле брже у медијуму са додатком 20% серума. У дуготрајним културама, 20 нг / мл ИГФ-1 одржава стабилно стање ћелија.

Д. Лее ет ал (1993) су упоредили ефекат композиције медијума културе (ДМЕМ, ДМЕМ + 20% говеђи серум, ДМЕМ + 20 нг / мл ИГФ-1) на синтезу ДНК у култури експлант хрскавице, монослоја културе и суспензији у агароза . Када су култивисани у агарози у присуству серума, аутори су приметили тенденцију груписања хондроцита у велике кластере. Ћелије гајене без серума и са ИГФ1, задржи кружни облик у агароза су сакупљене у малим групама, али није формирала велике агрегате. У монослоја синтеза ДНК био је значајно већи у серуму садржи медијуму него у медијуму обогаћеном са ИГФ-1; Синтеза ДНК у другој је била много већа него у неизграђеном окружењу. Када култивисање Хондроцити у суспензији у агароза у унцонцентратед медијуму иу медијуму са ИГФ-1, без разлике у синтези ДНК. Истовремено суспензија култивисање Хондроцити у агароза у медијуму без серума, је праћен повећањем уграђивањем радионуклеотид ³ -тимидина у поређењу са другим срединама.

Витамин Ц је неопходан за активацију ензима укључених у стварање стабилне спиралне структуре колагенских фибрила. Хондроцити, дефицитарни у односу на аскорбинску киселину, синтетишу подхидроксилиране нешивалне прекурсоре колагена, који се лагано излучују. Увођење аскорбинске киселине (50 μг / мл) узрокује хидроксилацију колагена типа ИИ и ИКС и њихову секрецију у нормалним количинама. Додавање витамина Ц није утицало на ниво синтезе протеогликана. Сходно томе, лучење колагена регулише се независно од лучења протеогликана.

[41], [42], [43], [44], [45], [46], [47]