Ембрионалне матичне ћелије

Откривање ембрионалних матичних ћелија - није настало случајно, већ се појавило на припремљеном тлу научних истраживања у области развојне биологије. Термин "матична ћелија" уведен је у медицину још 1908. Године на конгресу хематолошког друштва у Берлину од стране Александра Максимова у вези са хематопоетским ћелијама. Много пре изолација и припрема стабилних линија плурипотентних ембрионалних матичних ћелија у раном развоју процеса истраживачког користи стем терато- (ембрион-ћелије карцинома којом проучавали непознате механизме ембриогенезе, укључујући секвенце експресије гена раног и протеинских производа њиховог рада.

Али да ли је тоталипотенција људског генома непоправљиво изгубљена у процесу еволуције? Не, а ембриогенеза је доказ. Ако је то тако, онда када ће се у принципу остварити други пут еволуционог развоја? Вероватно када особа напусти Цосмос, где ће околишни услови бити релативно константни већ дуже време. Губитак кости (кости Деминерализација у бестежинском стању) врло споро подложни ремоделинг и регенерација може се сматрати као први корак ка процесу људске адаптације као врсте постојања у простору. Међутим, плаћање за други пут еволуционог развоја ће бити другачије - стерилност ће бити цена која ће се вратити свим ћелијама тоталипотенције и апсолутне пластичности. Тако се множи у овом свету "еволуционих камелеона" неће имати мејозе, отпочкованием. Али ћемо живети дуго. Теломеразна бесмртност је бесмртност амебе. У мултицелуларном организму, матичне ћелије су супстрат квантитативне и квалитативне дуговечности.

[1], [2], [3], [4]

Извори ембрионалних матичних ћелија

Извори данас од ембрионалних матичних ћелија за лабораторијским тестовима су Лине мишје тератокарцином (129 / св, Ф19, Ф8, Зин 40, ЦГР 86, Рл, ЦГО, ЈМ-1, Е14ТГ2а, ЦГРСб) и хумани тератокарцином (НтЕра-2, ТЕРА-2 , Х-9 цлоне), као и Хеß Траунеона. Међутим, присуство детаљно ћелијску пасош указујући имуну фенотип, резултате хромозом анализу иРНК профила експресионих изложених рецепторе и протеина интрацелуларни сигнални не компензује значајнијих недостатака тератокартсиномних линије ЕСЦ - брзог губитка тотипотенци и немогућности примене у клиничком испитивању и мешовиту диференцијацију у култури веома тешко изоловати чиста специјализована линија из хетерогене популације ћелија. Стога, обично извор ЕСЦ линија производи за клиничке сврхе, служи као унутрашњи ћелија масе бластоциста, ембриони појединачни бластомера од 8-целл фази развоја, ћелије Морула каснијим фазама и примарног прекрупе ћелију.

Треба напоменути да ћелије тератокарцинома, иако имају својство плурипотенције, имају значајно нижи плурипотентни потенцијал у односу на ЕСЦ. Њихова интеграција са ембрионалним ћелијама ретко доводи до формирања хи- мера, у којој се, поред тога, гамете са генотипом тератокарциномских ћелија никад не формирају. Верује се да је то због честог појављивања хромозомских абнормалности у култивацији ћелија тератокарцина: губитак И хромозома, разноликост трисомије, делеције или транслокације.

Покушаји разликовати људску ЕСЦ линију су предузети много пута, али овај задатак није могао бити решен, пошто је нормалним људским бластоцистима тешко приступити објектима. Осим тога, код људи, фреквенција хромозомских абнормалности је већа него код ембрионозе животиња. Превладавајућа већина раних људских ембриона добијених након ин витро ђубрења показује хаотични хромозомски мозаицизам и често постоје нумеричке и структурне аберације. Чак и касније, на стадијуму бластоцисте, само 20-25% људских ембриона чине ћелије са нормалним кариотипом. Било је скоро немогуће користити такве ембрионе да би се створио ЕСЦ, пошто су зиготес обично култивисани у фазе од два или четири бластомера, а потом пресађени у материцу. Само релативно недавно је била поуздана техника развијена за култивацију оплођених људских овула у стадијум бластоцисте. Увођење ове технике у праксу ин витро ђубрење не само да је повећало учесталост успешног имплантацијског исхода, него је и учинило нормалним бластоцистима приступачнији објекат.

Други плурипотентне извор матичних ћелија је примарна полне ћелије, које, за разлику од напреднијих родитељских популација герменативного епител, нису на површини бета-интегрина, али изражавају високу активност схелоцхнои фосфатазе. Треба напоменути да су у експерименту популација матичних ћелија, која су формирана из примарних полних ћелија, проучавана од 80-тих година прошлог вијека. Истовремено, развијена је техника за изолацију примарних ћелија ћелија из рудимента ембрионог гонада миша. Први неуспешни резултати гајење исконске клице ћелија ин витро сугерише узалудност тих напора, као ћелије, иако је преживео, али не множе и умро у року од првог дана. Касније је утврђено да примарне мишје ћелије заметка размножавају ин витро у присуству само у медијум културе растворљивих и мембрану везани фактора раста специфичних полипептидних. Бројне студије су показале да је неопходно присуство у медијум културе не само ЛИФ, већ мембранносвиазанних анд Стеел растворљивих фацтор (СИФ) за опстанак и пролиферацију исконским герминативних ћелија. Ови пептиди се производе соматских ћелија ембриона хомозиготних за мутације оф Стеел, а један од њих је лиганд за протоонкогена цКит.

Примарне ћелијске ћелије сисара и људи су екстрагонадног порекла и представљају извор клонског развоја линије сексуалних ћелија. Стартинг Лине примордиал герминативних ћелија, као и све ткива ембриона и ектраембриониц мезодермом даје епибласт (примарна ецтодерм) ране ембрионе који имају мозаика структурну организацију. Микрохируршко уклањање различитих делова раног ембриона успоставило је локализациону зону у епибласту клона посвећених прекурсора примарних ћелија ћелија. Са родаминдекстрана која је коришћена као маркер ћелије је утврдио да су прекурсори првобитни ћелије заметка налази у проксималном региону Епибласт, близу ектраембриониц ектодерма. Примарна линија сексуалних ћелија излази из 45-ћелијског клона, чија се алокација јавља на самом почетку гаструлације. Затим долази до сегрегације клона, а током гаструлације примарне полне ћелије улазе у екстембрионски мезодерм и налазе се у основи алантозне пупоље, иза примарног опсега. Одатле, примарне ћелијске ћелије мигрирају према вентралном крају ендодерма ендоцервикс, а затим активно кретају дуж мезентерије, попуњавајући гениталне ваљке на крају миграције. У процесу миграције, као иу првих 2-3 дана локализације у гонадном рудименту, примарне ћелијске ћелије активно пролиферишу и пролазе кроз осам репликативних циклуса. Ако на почетку миграције има око 50 примарних ћелија ћелија, у репродуктивним цистама ембриона миша са развојем од 12 дана, број примарних полних ћелија прелази 25.000.

Функционална сличност ЕСЦ и првобитних герминативних ћелија демонстрира потпуну интеграцију овог другог у унутрашње ћелијске масе Замена бластоциста и касније развој ембриона, ткива које се састоји само од потомака првобитни клица ћелије. Према другим карактеристикама мишја примарни герминативних ћелија ПГЦ су такође идентични, показујући способност да диференцирају у различитим правцима, да формирају ембриоид тела ин витро, а ин виво формирају тератомас када убризгане имунодефицијентних мишеве личе спонтани тератомас тестиса мишева лине 129 / тер.

Утврђено је да, када се дода ЛИФ средње и растворљивог мембранносвиазанного СИФ изолован примарне ћелије заметка 8-дана мишјих ембриона опстане и пролиферацију у култури 4 дана али онда умире. Штавише, период када култура смрти примећен исконске герминативних ћелија поклапа са фази развоја мишјих ембриона (12.5-13.5 дана), када су пупољци примарни гонадалних жене заметка ћелије улазе мејозе, ау мушким примордијалних клице ћелије су блокиране митотичку дивизија. Међутим, ако додате на животну средину не само раст фактора ЛИФ и ФСУ, али и ФГФ2 су примарне ћелије заметка наставити пролиферироват, и субкултуре су формирани мобилни колоније могу репродуковати чак и након што је уклоњен из окружења фактора раста (ФСИ и ФГФ). Такве ћелије могу се дуго култивисати на субстрату ембрионалних фибробласта без додавања растворљивог фактора раста ЛИФ. Ове стабилне ћелијске линије добивене су од примарних герминативних ћелија које су предложене да се називају ембрионалне ћелијске ћелије. Овај термин не може се сматрати успешним као када култивисане ЕГ-ћелије не могу добити ембрионалне ћелије заметка, способне вршења наредне фазе оогенеза или сперматогенезу. То је због чињенице да ЕГ-ћелијске линије, иако изведени од исконских герминативних ћелија, али у култури стицања својства ембрионалних матичних ћелија плурипотентних губе способност да почињења герменативние линију. Другим речима, примарне ћелије заметка током култивације изгубе својства гамете претворене у прекурсори и ЕСЦ налик плурипотентних ћелијама.

Запажено је да када се имунодефицијент ЕГ мишеви примењују, тератоми се не појављују. Претпоставља се да је губитак способности ћелија ЕГ ћелија да иницирају тератоме због чињенице да ове линије нису створене директно из култивисаних примарних герминативних ћелија, већ су добивене из ћелија изолованих од ембрионских тела. Стога је могуће да су потомци плурипотентних, али већ посвећених ћелија.

Треба напоменути да постоје основне разлике између ЕГ ћелија и примарних ћелија ћелија. Последње не омогућавају добијање ембриона химерних миша, што указује на недостатак способности примарних ћелија ћелија да се интегришу у унутрашњу ћелијску масу или тропхектодерму. Карактеристике популације примарних сексуалних ћелија су више сличне оним везаним линијама соматских ћелија каснијих ембриона, чије уношење у бластоцист такође не доводи до стварања химерних ембриона.

Технике модификације култивисање ембриоид тела добијене са ЕГ-агрегацију ћелија које допушта селекције на селективним медије да прими још једну популацију плурипотентних ћелија, под називом "ћелије добијене из ембриоид тела (ембриоид тела пореклом ћелије - ЕБД-ћелија). Способност ЕБД ћелија да се дуго времена множе у култури која омогућава стварање стабилних ћелијских линија преданих ћелија. Добијени су клони ћелија који изражавају широк спектар мРНК и протеинских маркера специјализованих ћелија. Овај приступ као резултат доказано да су примарне сексуалне плурипотентне ћелије људске, и диференцирају ин витро у различитим типовима ћелија: неурона, глиа, васкуларни ендотел, хематопоетских ћелија, мишић, и ендодермал ћелије.

Алтернативни извори ембрионалних матичних ћелија

Алтернативни извор људских ЕСЦ линија могу бити хибридне ћелије. Имплантација у утерус псеудопрегнант кравље гетерогеномнои структури добије када спајањем преко електропорисања фетуса хуманих соматских ћелија са јајних крава које су претходно уклоњени из пронуцлеус, омогућава да прими унутрашњу ћелија масу пре имплантације ембриона вештачких развојне фазе. За ову сврху, у првом кораку се добија из бластоциста јаја крава са трансплантираног хуманим ћелијама једра.

У другој фази, ембриобласт се екстрахује из бластоцисте, а из њега - ЕСЦ према Тхомсоновој методи. Важно је напоменути да су најбољи резултати у раздвајања ЕСЦ редовима Овим поступком добијено коришћењем језгра фоликуламе ћелијама или првобитним герминативних ћелија које опстају у људском телу у стању хибернације. То је због чињенице да је крава јаје пресађене хуманим ћелијама језгро неукороцхенние треба имати високу активност и теломера теломеази да избегава преурањено старење ЕСЦ клонова изведених из хибридне јајета (Репин, 2001). Познато је да су најважнији интрацелуларни маркери ЕГФ протеини Оцт3, Оцт4, Тцф, Гроуцхо, који припадају такозваним протеином хроматинског силенцера. Пригушивачи пружају нарочито компактно паковање хетеророматина, који спречава стварање петљи еухроматина. Пакет хроматина посредован овим протеини корелира са тоталипотенцијом генома ЕСЦ. До данас је утврђено да су зрели овали говеда и људи једини тип специјализованих ћелија који садрже високе концентрације протеина из силенцера у цитоплазми. На основу тога, развијен је метод за производњу хибридних ЕСЦ-а преношењем соматских ћелијских језгара у не-нуклеарне овуље крава. Прелиминарне студије ин витро показале су да цитоплазма јајних ћелија крава обнавља тотално-генотип генома соматских ћелија код 12-24 сата гајења.

Од посебног интереса су подаци о карактеристикама преимплантационог развоја људских ембриона, који указују на каснију замену тотипотентних ћелија популацијом плурипотентних ћелија него код мишева. Истраживање ћелијских трансформација показало је да ћелије унутрашње ћелијске масе људског бластоцисте, поред ЕСЦ-а, такође производе ћелије трофобласта, што указује на њихову укупну потенцијалност.

Познато је да на стадијуму бластоцисте постоје двије различите ћелијске популације. Један од њих је спољни слој бластоциста, трофодермма, изведеног из трофобластних ћелија и других ембрионалних компоненти плаценте. Друга популација ћелија је груписана у густу масу која се дотиче унутрашње површине тропхектодерма. Ћелијска популација унутрашње ћелијске масе изведена је из свих ткива и клица ембрионих органа. На стадијуму касног бластоцисте, из унутрашње ћелијске масе формира се екстра-ембрионални ендодерм и формира се епибласт (примарни ектодерм). У исто време, ћелије епибласта задржавају плурипотенцију, док је способност да се разликују ћелије екстра-герминалне ендодерме ограничене.

[5], [6], [7], [8], [9], [10], [11]

Добивање људских ембрионалних матичних ћелија

Донедавно се сматрало да тропобласт добити од хЕСЦс немогућим. Међутим диплоидне лине тропхецтодерм матичне ћелије изоловане из бластоциста у медијуму који садржи, уместо ЛИФ и ФГФ2 хепарина, увећава и претвара се матичне ћелије. Ако уклоните из своје средине ФГФ2 су тропхецтодерм ћелије престану узгој, они почињу ендоредуплицатион хромозома и ћелијских елемената трофектодермалние постепено претворила у џиновске тропобласт ћелија. Вјероватно, ЛИФ не стимулишу пролиферацију ћелија тропхецтодерм услед чињенице да ФГФ2 покреће механизам транссигнализатсии као ФГФ2, везивање за рецептор цитоплазматског (ФГФР2), активира МАП киназе у цитоплазми - ЕРК1 и ЕРК2. Сходно томе, када су инкорпорисани у ћелије бластоциста једног сигналног пута (ЛИФ - гпл30 - ЈАК-Киназа - СТАТ3) унутрашња ћелија маса ћелије трансформишу у плурипотентних хЕСЦс док активирање други механизам трансмембрански сигнализације (ФГФ2 - ФГФР2 - МАП киназе ЕРК1 / ЕРК2) матичне ћелије у бластоциста тропхецтодерм формиране. Избор сигналног пута, опет зависи од активности оцт4 гена. Овај ген који припада ПОУ домен, који се налази на локусу Т 17 аутозома и се изражава током оогенеза, у сламању периоду као иу ћелијама унутрашњег ћелијске масе бластоциста иу исконским герминативним ћелијама. Функционална улога оцт4 ген кодира фактор транскрипције неопходан за појаву плурипотентних ћелија, њихову диференцијацију и дедиференцијација.

Израз оцт4 гена у ЕСЦ-у варира зависно од интеракције овог транскрипционог фактора са кофакторима. Упутна регулација оцт4 експресије у бластоцистима показала је да када се његова активност смањује, половина ћелија формира тропхектодерм, док с повећањем индуциране експресије окт 4, претежно ЕСЦ се јавља.

У експерименту, ЕСЦ не може превести у низу гајењем тотипотентни бластомера цлеаваге сценски иу фази гаструлација и каснијим фазама ембрионалног развоја. Моусе ЕСЦ обично издвоји ат 3.5-4.5 дана гестације, што одговара шестом (једним слојем бластоциста) и седмо фазе (двослојног оф бластоциста - рани јаје цилиндар) нормал ембриогенезе. Очигледно, само у преимплантационом периоду ембриони мишева садрже целуларне популације које се могу трансформисати у ЕСЦ. Сходно томе, изолација ЕСЦ линија је могућа само у одређеним фазама ембрионозе. Тотипотентни, у смислу могућности за развој одрживог ембриона из плодових овојака и плацента су зигот и настао током пуцања бластомера. Губитак укупне јачине ћелијске ћелије почиње у касној фази морула, када даљња бластомера комминуција зависи од њихове локације. Рани Морула блаетомери задржавају тоталипотенцију, јер експерименталне манипулације са променама на њиховој локацији, на пример, инверзијом њихове локације, не спречавају развој пуног ембриона.

Утврђено је да је ефикасност ослобађања ЕСЦ у линији под утјецајем стања бластоциста у вријеме њиховог експлантације. Употреба бластоцист након седмодневног симулације дијапаузе у гениталном тракту мишева, оваријактомизованих на 3,5 дана гестације и третиране са прогестероном, доприноси успјешнијем раздвајања линија ембрионалних матичних ћелија. Претпоставља се да се у таквим условима повећава број бластомера који стварају унутрашњу ћелијску масу. Такође је могуће да се ћелијски циклус проширује и већина бластомера улази у Г0 фазу.

Штавише, стварање стабилних плурипотентних ХеСц линија зависи од генотипа ембрионима: врло лако примећују од ЕСЦ Мурине бластоцист лине 129 је знатно теже их добију користећи мишеве ЦС7БЛ / 6 и немогуће изолује линију из хЕСЦс бластоцист ЦБА / Ца мишева. Очигледно, рани ембриони поседују неке генетске особине које утичу на развој плурипотентне линије ЕСЦ. Међутим, када изолована култивисане епибласт, као и селективним избором диференцијација хЕСЦс ћелијску линију од раних ембриона ЦБА / Ца мишева су даље распоређени.

Доказана стандардна техника за добијање ЕСК линија из бластоциста је дата у лабораторијским приручницима о техникама експеримента са раним ембрионима. Експерименталне ЕСК линије се такође могу добити култивацијом изолованог епибласта (примарног ектодерма) 4,5-дневних ембриона миша са прилично сложеном микрохируршком техником и модификованим условима узгоја. Сложеност ове процедуре је оправдана, јер је фреквенција формирања линија ЕСЦ била много већа него у раду са унутрашњом ћелијском масом бластоцисте.

Да би изоловали линије ЕСЦ, сваки клон се преноси у микро-бунар, узгаја се агрегат од 40-60 ћелија, поново се распршује. Вишеструки понављања овог поступка омогућава добијање овековечен ЕСК линија са максималним пролиферацију стопа нормокариотипних ћелија везаних за пластику која је преко пролаза 50-100 задржавају тотипотенци и високу теломеразном активност. У процесу подршке линија ЕСЦ Највећа опасност је загађењем или серум бактеријске ендотоксини - чак трагове ендотоксином концентрације у медијуму културе проузроковало смрт код људских маса незрелих герминативних ћелија. Са пажљивом контролом раста линеарног и благовремено дисперзија ЕСЦ у култури способни симетричне фисија, у коме оба ћерке ћелије остају плурипотентне иу стању да изврши неограничен број циклуса ћелија, одржавајући диплоидна кариотип и укупну потенцију.

Избор чистог популације људских ЕСЦ се може обавити након трансфекције у њихов геном рекомбинантне ДНК молекуле који садрже ген који кодира синтезу зеленог флуоресцентног протеина (ГФП). Експресија ГФП повећава са све ЕСЦ у окружењу подржава њихову пролиферацију, док је почетак диференцијације нивоа експресије гена је смањена, што омогућава одабране на селективне средње чисте стабилних, плурипотентних ћелијским линијама. Када се култивише са ГФП селекцијом ЕСК, учесталост колонија је значајно повећана, јер у условима селекционих усева елиминише се моћан антипролиферативни ефекат диференцираних ћелија.

Превођење хуманих ембрионалних матичних ћелија у складу помоћу њиховог метода изолације преимплантатион ембриона (корак 80-120 ћелије), који остају после ин витро фертилизације поступку. За ово, вештачки добијени "вишак" ембриона механички су распршени у Делбеццо-Неедле окружењу. После обележавањем ћелије са моноклоналним антителима селективним флуоресцентни маркер ембриобласт изолованим ћелијама. Ембриобласт је диспергован у поједине ћелије користећи мешавину дисаспазне колагеназе. Раздвојене ћелије су гајене у посебној медијуму (80% Делбекко средњи + 20% феталним говеђим серумом у присуству 500 нг / мл ИЛ-6, ЛИФ и СЦФ) на монослоју плодових фибробласта Феедер 3 прве пасусе. Тако преживљавање и пролиферацију матичних и родитељских ћелија одржава излагањем ИЛ-6, ЛИФ и СЦФ. У таквом окружењу, суспензија хЕСЦс расту клонови осхаренних слободних ћелија да раздвојене понављаним благим вишеструким пипетирањем. Нови клони се појављују у суспендованој култури 5. И 7. Дана. Максимална стопа раста ЕСЦ постиже се поновном дисоцијацијом клона на стадијуму од 10-15 ћелија. Затим, сваки клон се преноси у микроцелу и расте на агрегат од 40-50 ћелија. Поступак се понавља више пута у пасусима, повећавајући запремину културе до густине од 5-10 милиона ћелија по 6-цм посуди. Коришћењем такав Тхомсон пасажу је изолован 10 клонова бесмртне људске ЕСЦ који преко пролаза 100 задржавају високу теломеразном активност, способност да интензиван пролиферације и фенотипске карактеристике Минимална укупна потенције, уз диференцијацију у било којој 350 специјализованих ћелијских линија које су изведене екто-, мезо - и ендодерм. Диференцијација хуманог ЕСЦ почела (на промену средње, додавањем и отклањање серум ЛИФ) са ћелија везивања за подлогу, указујући на развој цитоскелета и испољавање адхезивних рецептора. Важно је да са неограниченом пролиферацијом ЕСЦ-а, сачува се нормалан кариотип.

Други начин изолације човечјих ЕСЦ линија базиран је на примарним полним ћелијама. Експерименталне студије показале су да се линије Еу-ћелија могу добити од гениталних плакова старих 12,5 дана мишева. Међутим, у овим случајевима учесталост формирања линија прогениторних ћелија била је знатно нижа него у експериментима са ранијим ембрионима. Истовремено, примарне ћелијске ћелије из гонада ембриона мишева гестационог доба од 13,5 дана углавном нису способне да се трансформишу у линије.

Прве стабилне линије плурипотентних ћелија ЕГ ћелија добијене су од примарних гоноцита изолованих из гениталних пупкова старих ембриона 5-9 недеља. Изоловане ћелије су култивисане на подлози од инактивираног мишје ембрионске фибробласта у ДМЕМ медијуму са феталним серумом, коме је додат меркаптоетанола, форсколин, као рекомбинантних фактора људске раста (ФГФ и ЛИФ). Након 7-12 дана, мултицелуларне колоније су се појавиле у култури, према морфолошким карактеристикама и молекуларним маркерима који одговарају ћелијама ЕГ ћелија. Након агрегације, ове ћелије формирале су ембриоидна тела, са даљим развојем које су се појавиле специјализоване ћелије, карактеристичне за деривате свих три ембрионална лишћа. Током 10-20 пролаза ЕГ-ћелијске линије задржале су нормалан кариотип и нису изгубиле плурипотенцију.

Такође је показано да комбиновани ефекат ЛИФ, мембранских и растворљивих челичних фактора, као и ТГФ-б, модифицира програм за развој примарних ћелија клица. Умјесто да зауставе митотске поделе и почну да се разликују према оогенези или сперматогенези, примарне сексуалне ћелије настављају да пролиферишу. После неколико додатних митотских циклуса они постају слични ћелијама епибласта, а губитак особина прекурсора ћелија ћелија трансформише се у плурипотентне ембрионалне стем ЕГ ћелије.

Тако су у 1998. Години имортализоване линије примарних сексуалних ћелија биле изоловане од сексуалног рудимента ткива хуманог феталног аутопсије. Ембриогенеза хуманих примарних герминативних ћелија појављује у жуманца кесе у трећој недељи развоја, и на 4-5тх недељама, ове ћелије мигрирају у области сексуалног туберцулум, где формирају популацију примарних дормантние гоноцитес. У неактивном стању, примарне ћелијске ћелије остају у пуном стању до рођења. Примари клица ћелијске линије су екстраховани из фетуса гениталија туберкулозе 5-9 недеља старих ембриона добијеним ек темпоре тканина која се третира са смешом типа колагеназе ИВ-В, Хиалуронидасе и ДНасе за квантитативно и квалитативно приносу повећање ћелија. Примарне ћелијске ћелије у ткивима тубалног ткива гена фетуса окружене су Сертоли стромалним (мезенхималним) ћелијама. Функционална сврха Сертолијеве ћелија је производња анти-апоптотичних фактори (Фас-лиганд), митогена и имуносупресивних агенаса који штите матичних ћелија сексуалне од имуног напада тела. Поред тога, стромална микроекологија гениталног туберкулозе игра важну улогу у сазревању гаметима. Изоловане примарне ћелијске ћелије су засадјене у култури преко стромалног слоја хранилице који се састоји од феталних фибробласта првих три пролаза. Најефикаснија комбинација митогена је комплекс који садржи ЛИФ, ФГФ и форсколин (стимулант за формирање цАМП-а). Пролиферације исконске ћелије заметка у витро захтева додавање феталног серума, у присуству примарних гоноцитес репродукцију у клонова култури пратњи формирањем глобуларних, неадхерентне ћелије на подлогу.

Амерички Национални институт за здравље на основу резимира постојеће информације о начину расподјеле људских ЕСЦ линија из бластоцист је направио прелиминарну закључак да је успешно додјела ЕСЦ је највероватније када се гаје бластоцист са добро формиране унутрашње ћелијске масе (Матичне ћелије: научни напредак и будуће истраживачке правце Нат. Инст, Хеалтх УСА). Са ове тачке гледишта, најбоље извор ЕСЦ да створи линије су људски бластоциста 5. Дан развоја, од којих је расподјела унутрашње ћелијске масе треба пажљиво уклонила тропхецтодерм. Исолатед иннер целл масс састоји у овој фази 30-35 ћелија треба да се гаји на супстрату мишјих ембрионалних фибробласта, што је одлучујућа услов за формирање колонија у култури хЕСЦс.

Анализа фенотипских карактеристика ембрионалних матичних ћелија

Од посебног интереса је интерспецијална компаративна анализа фенотипских особина ЕСЦ. Утврђено је да људски ЕСЦ колоније - густа кластери згњечити епителних ћелија, док су мишеви ембриоид цалф састоје растреситог конгломерат заобљеним ћелија. Код ЕСЦ-а, индекс односа нуклеарне плазме је мањи него код миша ЕСК. Ембрионалне матичне ћелије мајмуна формирају више равне ћелијске колоније са неуједначеним ивицама. У раним клоновима примата ЕСЦ, једне ћелије се лако могу видети. Пролиферацију хЕСЦс све врсте животиња не експримира МХЦ класе И и ИИ. Истовремено, људска ЕСЦ дају позитиван одговор на антитела Тера 1-60 анд ГЦТМ-2, који указује на присуство на њиховој површини кератин / Хондроитин сулфат протеогликани, карактеристична за ембрионалног (тератомас) -картсиномних матичних ћелија. Експресија у хЕСЦс свих врста животиња оцт4 гена сугерише да, упркос разликама у фенотипских људи и мишева, очигледно активиран истог скупа гена одговорних за одржавање плурипотенцију (Перу, 2001). Поред тога, ЕСЦ линије изведене из ембрионалних пацова, свиње, зечеви, примате, и говеда, имају сличне морфолошке карактеристике, слична сет молекуларне идентификације маркера и скоро идентичне молекуларни механизам за имплементацију ембриогенези програма који омогућава да узмете свеж поглед на питање ксенотрансплантације .

За разлику од нормалног ембриогенезе ин виво, ин витро пролиферацију хЕСЦс не прати формирање клицине слојева и наставља да блокира хомеотичних Нохгенов позадину, тј без органогенезе. Пошто сегментацију гени не функционишу у култури хЕСЦс немогуће репродукује такве периоде ембриогенеза као таб одсечак сегментација нуклеуса, формирања жуманца кеси, алантоисној провизорна и других органа и ткива. Културни ЕСЦ су замрзнути на почетку формирања 350 ограничења линија специјализованих ћелија. Стога, цлоне помоћне родитељских ћелија и централно локализовани ПГЦ су једини модел ембриона током развоја у којима се различити региони ткива формира у једној фази се разликују од специјализованих ћелија изведене, међутим, од заједничких прекурсора. Иако минималног нивоа рецептора на површини хЕСЦс, задржавају способност обављања примитивних Морпхогенетиц процесе симулирајући највећи раног ембриона структуре: цистерне са хЕСЦс културе и агрегатне облике структуре налик бластоциста или чак касније ембриона (јаја цилиндара). Такви агрегати суспензије су на одговарајући начин названи једноставним и сложеним ембрионским тијелима.

Када се помеша диференцирају у различите ћелије ембриоид тела истовремено изразила ране гене ектодерма (оцт3, ФГФ-5, нодуса), ендодерм (гата-4), мезодермом (брацхиури), кардиогени мезодермом (ПКХ-2,5), неуралне цеви (мск3 ) и хематопоезе (елкф). Користећи различите комбинације цитокина и фактора раста за циљање формирање КЛИЦИН ЛИСТ ћелија ин витро у великом броју случајева било је могуће добити ембриоид тела, који су пожељно експримирани гени ецтодерм или мезодермом, што отвара пут до моделирање гаструлација и ране фазе органогенезе.

Клонска раст хЕСЦс доказ асиметричне деобе ћелија у којима је само један од ЕСЦ у центру клона задржава не-ограничавајући капацитет репродукције, а друга ћерка ћелија доводи до стварања родитељских ћелија, диференцијација већ долази. Стога је брзина умножавања клона на периферији ембрионог тела већа него у центру. Маргиналне ћелије растућег клона пролазе кроз спонтано поремећено диференцирање, мигрирају или умиру механизми апоптозе. Ови догађаји одређују судбину клона уколико стопа пролиферације превазилази стопу миграције и апоптозу, клон величине наставити да расте, стабилизација јавља са једнаком апоптозе и стопе формирања нове ћелије брзине, назадовања - реверзном однос ових процеса. Родитељских ћелија деле симетрично, тј оба ћерке ћелије затим диференцирају у зреле специјализоване ћелијским линијама. Однос ЕСЦ / родитељских ћелија варира, али је увек број ПСЦ је само део једног процента становништва родитељских ћелија. Због тога само пажљиво пипетирање и правовремена дисагрегација клонова могу повећати број ЕСЦ-а у култури. Да би се добио максимални принос ЕСЦ, најефективнија је била дисагрегација клонова у стадијуму од 10-12 ћелија. Правац и степен диференцијације ћелија у ембрионалном телу зависи од њихове локације. Спољне ембриоид боди ћелије не експримирају ген и оцт4 подвргавају диференцијацију у основним ендодерм ћелија из којих касније формираних епитхелиоид ћелије и париетални ектраембриониц висцералну ендодерм. Унутрашње ћелије ембрионог тела изражавају оцт4 гену и задржавају плурипотенцију за 48 сати културе. Али онда морфолошки реорганизација се јавља у епителним монослој култура почиње и експресија гена који контролишу развој примарне ектодерма. Даље, процес укупног поремећеног цитодифферентиатион почиње са појавом различитих типова ћелија који су деривати сва три слоја клица. У процесу спонтаног диференцијације ембриоид телесне ћелије првобитно појављују агрегата ендодерм маркере у виду фрагмената (цисте) жуманца сац. Даље, у овим структурама појављују се ангиобласти и ендотелне ћелије растућих капилара. У завршној фази спонтаног диференцијације унутрашњих ћелија ембриоид тела развијамо разне терминално диференцираних ћелија, укључујући неуроне, глијалних елемената кардиомиоцитима, макрофага и еритроцита. У појединим апроксимацији (с обзиром на просторну инверзију листова формирају рани ткиво) преко ембриоид телима ин витро може истражују Морпхогенетиц процесе и анализирају молекуларне механизме плодових цитодифферентиатион почетног периода и успостављање улоге специфичних гена у реализацији ових процеса.

Тако су унутар клона ћелије у којима се откривају различити програми генетског развоја - ЕСК, рани прогенитори и различити популацијски прогенитор. Гајење ЕСЦ методом капљивог капљица или масовне културе без подлоге и без додавања ЛИФ у медијуму неизбежно доводи до стварања ембрионских тела. Морфологија ћелија спољашњег и унутрашњег слоја ембрионских тела је различита. Спољни слој састоји се од великих процесних ћелија. Њихова површина, окренута окружењу, прекривена је бројним микровилима. Спољашњи слој ћелија је одвојен од унутрашње базалне мембране која спомиње Реицхертову мембрану, док су ћелије унутрашњег слоја ембрионских тела цилиндрични епител. Морфолошки, унутрашњи слој, иако садржи многе ћелије за поделу, више подсећа на недиференциране колоније ЕСЦ.

Карактеристике људских ембрионалних матичних ћелија

Одсуство паренхимских-мезенхималне интеракције на позадински сигнал блокирања гене хомеосис узрокује поремећени раст ПГЦ у култури, јер картица је сломљена и формирање инфраструктуре Услова органи. Неорганизована раст и неуредно спонтано диференцијацију хЕСЦс у култури због недостатка мезенхијалног поводом строме оквир будућих органа: ин витро могуће је формирање милиона хепатоцита, али не можете добити било сегменте јетре, укључујући такве структурне и функционалне елементе, попут синуса, простору Диссе и Купферовим ћелијама.

Верује се да је плурипотенцију на ЕСЦ реализује искључиво ембриогенеза да формирају ткива и органе ембриону, а пупчана врпца и постељица су изведени тропобласт. Затворени у љусци трофектодермалнуиу ЕСК константно генерише ћелијски клонови провизорна реализује програм развоја од комбинаторне иРНК булк Нохтеиаов топографски матрица, која предодре просторном распореду, облик, димензија, број привремених и дефинитивних ћелијама органа и паренхима склоп у структурном и функционалну целину. Истовремено ЕСЦ су једини тип ћелије у којој је молекуларни механизам реализације њихових потенцијала у потпуности одвојена од генетског програма развоја и ЕСЦО-самих лишеног могућности интеракције са другим ћелијама услед блокаде како перцепција рецептора и транссигнализатсии система. Међутим, адекватни за активирање ЕСЦ резултати у постепеном распоређивање ембриогенези програма крајњој тачки рођења је потпуно формирана и спремна за ванматерични живот организма се састоји од милијарди ћелија. У овом кратком времену, али незамисливо дуг у ћелијском путање простор неминовном појаве грешака у молекуларним механизмима који обезбеђују виталне функције ћелија, ау програмима који контролишу њихову пролиферацију, диференцијацију и специјализацију. Стога, у модерним Фармакогеномика посматрати одвојено болест молекуларне уређаје, и програмирање ћелија болест. А акција већине нових лекова усмерених на корекцију име програма диференцијације, пролиферације и органогенезе, као и регенерације органа и ткива. У организму одраслог преко ЕСЦ постаје могуће контролисати понашање стем / родитељских ћелија трансплантираних у мозга, јетре, слезине, коштаној сржи и другим органима човјека на поправку оштећених паренхима органа прималаца због диференцијација и специјализација донатор месенхималне ћелије очуваних матрицу. У суштини, тотипотенци Програм је покренуо још ооцита генома нивоу, зиготес и бластомера, али ове ћелије још увек није могуће клонирати и пасажа у количинама потребним за потребе екпериентал и практичној медицини. Дакле, ЕСЦ представља јединствен извор генетских информација који садржи тродимензионалну линеарну рестрикциону мапу ембриона и кодексе специјализованих ћелијских линија током гаструлација.

Неограничене могућности регенеративног ЕСЦ због чињенице да њихов геном, за разлику од генетског апарата диференцираних соматских ћелија, одржава плурипотенцију. Једна од манифестација успавано стање кореном у ЕСЦ генетску информацију је тзв минимум фенотип - на површини ЕСЦ изражавања ограничен број рецептора и стога распоредио врло мало програма за интеракцију транссигнализатсии нуклеарне апарат ћелије са својим микроокружења. Против позадини хибернације гена одговорних за ограничавање специјализованих ћелијских линија и диференцијације ћелија, активира само 30 од 500 гена чије производе обезбеђују комуникацију ћелија са околном микроокружења. Методом серијског анализе експресије гена показала да општост Главног функционалних генома поља регулишу енергију и метаболизам у соматским ћелијама и ЕСЦ у последњој утврден изузетно смањене мРНК рецептора Г-протеина, други гласници, транскриплазама, кофактора изражавање и репресију , то јест, читав систем трансмембранског преноса регулаторног сигнала у ћелију. Ово је последица недостатка или веома ниске експресије гена транс-аанализације. Током диференцијације индукованом у геному ЕСЦ 18 операције је престала синхроно функционише гене за бацкгроунд активација транссигнализатсии 61 гена који контролише синтезу ћелијске адхезије рецептора, компоненти екстрацелуларног матрикса, ограничење транскриптазе мессендзхерних елементе и систем преноса сигнала за нуклеарну јединицу са ћелијском мембраном рецепторе плазме. Истовремено блокирао експресију гена одговорних за синтезу протеина пригушивача, као експресије гена коингибиторов пружање тотипотенци генома хЕСЦс.

Пронађени су генетски маркери за ћелије свих три ембрионална леци. Идентификација ектодермалних ћелија слој наставио експресију гена чвора, оцт3 и ФГФ-5, мезодермалног ћелије - ген брацхиури, зета-глобин, ендодерм - ат гата-4 експресије гена. У нормалном ембриогенезе током гаструлација приметио активну миграцију незрелих популација матичних и родитељских ћелија, локално одређивање подручја фацијалних костију лобање, неки делови мозга, периферног нервног система, срчаног спроводног система и тимуса ткива које се формирају клонова расељено ћелија. Целл етикетирање ране гене КЛИЦИН ЛИСТ олакшава топографског анализу миграције родитељских ћелија у ембриону у развоју. Утврђено је посебно оних ћелије у агрегати ембриоцарцинома П19 експресију прве гена мезодермом брацхиури почиње током смањења генске експресије ткива активатора плазминогена, а-фетопротеин, кератина 8. И кератина 19, који су маркери еарли мезодермом миграторних популација. Сходно томе, формирање ткива мезодермалног порекла почиње тек након процеса миграције и седиментације тачке мезодермалног родитељских ћелија.

Са екстремно ограниченим фенотипских карактеристика и одсуства већине блокова транссигнализатсии ЕСЦ ипак исказали молекуле рецептора који се могу користити да их идентификује. Важно је напоменути да су антигени-маркери ЕСЦ-а код људи и примата били уобичајени. Најчешће се користи за хЕСЦс етикетирања обележена антитела на антигене мембранносвиазанним ССЕА-3, ССЕА-4 (уникуе антигени липида представљају сложену Гликолипидни ГЛ7 са сијалну киселину), као и висок полимера гликопротеини ТРА-1-81, тра-1-60. Надаље, хЕСЦс изражавају специфичну ембриониц антигену ССЕА-1 и ендогени алкална фосфатаза, као специфичан транскрипције фактор Оцт4. Ово последње је потребна за одржавање хЕСЦс пролиферације механизма - специфични транскрипциони фактор Оцт4 ген активира експресију раста фибробласта фактора 4 генске експресије и стабилизује бокс одговорне за не-ограничавајуће ДНК редупликација у незрелих ћелијама. Најважнији унутарћелијски маркер протеини су Оцт3, Оцт4, Тцф и Гроуцхо, у вези са протеинима кроматина пригушивачима.

Скоро одмах након дугорочних култивисаним ЕСЦ покушаја неуспешан, а организам први пут припремљен културом матичних ћелија изолованих из миша бластоцист и култури примарни герминативних ћелија, почео сценска ЕСЦ плурипотенцију студије капацитета када се администрира у раним фазама развоја ембриона. Показано је да у Морула и бластоциста ПГЦ могу да формирају химерни ембриона у коме давалац ПГЦ потомци детектовани у свим соматским ткивима па чак иу гамета. Тако, у Девелопментал Биологи помоћу ЕСЦ Сцриптинг "мост" између експерименталним испитивањима ин виво и ин витро, што значајно повећали могућност проучавања процеса Означ примарне ткива и органа, њихово диференцирање и ембрионалних органогенезе.

Добро је познато да ин виво током ембриогенеза ЕСК интегрисан у ћелијску масу раног ембриона, и њихови деривати се налазе у свим органима и ткивима. ПГЦ колонизовали клице линију химерно герминативних ћелија, од којих потомци облика пуне јаје и сперму. Ембрионске матичне ћелије су цлоногениц - појединачни ПГЦ може створити генетски идентичан са колонију ћелија са молекуларних маркера који обухватају оцт4 генска експресија и алкална фосфатаза, високу теломеразном активност, као и експресију одређених ембрионске антигена.

Да проучи механизме ембриогенеза користећи технику хЕСЦс цхимеризатион Морула стварањем биолошке структуре, која се налази изван слоја тетраплоидна бластомера примаоца и донатора ПГЦ примењују у. Тако тропобласт формирани од потомака тетраплоидна бластомера примаоце који омогућава имплантације плацентације и донатора ПГЦ делују као ћелијска маса унутрашњег, који је направљен од одрживе гермитивних примарних тела и родитељских гамета. Студи ЕСЦ вредност лежи не само у томе, када је манипулација ин витро са њихов геном задржане плурипотенцију, већ иу чињеници да уз уштеду способност да учествују у формирању хЕСЦс примордиал семенки ћелија химерни ембриона. Показало се да само једна потомци генетски модификованих ПГЦ колонизује све основне и микробе формирају тканине химерни ембрион добијене агрегације или цоцултуре ћелија са 8-ћелијском ембриона. Када трансплантиране у мишеви Морула ЕСЦ трансфектоване са зеленим геном флуоресцентни протеин, флуоресцентне потомци ћелија нађена у свим испитиваним ткивима ембриона у развоју (Схимада, 1999). Трансплантација ЕСЦ у Морула може створити одрживе мишеве, тело које се састоји искључиво од потомци поклонио ЕСЦ, што отвара могућности за различите терапеутске могућности клонирања. Сада такав методички приступ је успешно примењена за проучавање проблема развојног биологије, посебно, може да анализира генетске механизме инактивације Кс хромозом или епигенетском нестабилности хЕСЦс. Трансплантација ЕСЦ у рани ембрион се такође користи у биотехнологији у пољопривреди, као иу експериментима са генетском терапијом.

Трансплантс генетски модификованих хЕСЦс се користе за испитивање циљних ћелија мутираних гена. Ин витро култивисани ЕСЦ се користе у биотехнологији за стварање ноктију мишева. За ту сврху, путем хомологе рекомбинације да буду уклоњени из ЕСЦ студије гена (нокаут) и селективни медији луче ћелије недостају овај ген. Затим се избацивање ЕСЦ-а убризгава у бластоцист или агрегирано са бластомерима моруле. Тако добијени Химерни рано ембриони су трансплантиран у реципијента жена и новорођеним мишевима изабрани међу појединцима са гамета, нуллизиготними овог гена. Према овој технологији створио многе линије нокаут мишева, који имају широку примену у експерименталној биологији и експерименталне медицине. На овим биолошким моделима проучавали вредност одређених гена у ембрионални развој, као и њихову улогу у механизмима болести и патолошких стања код људи. Осим тога, линије ноћних животиња се користе у фази претклиничког тестирања нових метода генске терапије. На пример, коришћењем трансфекције гена у ЕСК нормалном алела гена мутанта управљају ефикасно исправљен мутацију, удари хемопоиетиц систем. Увођење ванземаљских гена у ЕСЦ омогућава стварање линија хомозиготних трансгенских лабораторијских животиња убрзаном брзином. Међутим, треба напоменути да је техника усмерена рекомбинације делеција гена поуздано разрађен још само релативно ЕСЦ мишеве. Коришћењем мишје ЕСЦ доубле кноцкоут инсталиран функционалну улогу површине кластер гена на хромозому 7 (копија геномске региону 19 минутес хуманом хромозому), а проксималном део 11. Хромозома (копију хумани 5д хромозом) - брисање ових гена у ЕСК мишеви су дозвољени да процењују функцију њихових аналога код људи.

Функцијски цапацити Студије хуманих ембрионалних гена, трансфекција у гену који лабораторијске животиње дозвољене хЕСЦс нарочито крипто појасни улогу гена на картици и формирају ген кардиогени мезодерма, пак-6 - ин ембриогенези ока. Чини први експресију гена незрелим пролиферацијом картице ЕСЦ тератокарцином и бластоциста мишеви потврдио огромну репресију у ЕСК транссигнализатсии гена. Комбинација мутаната ЕСЦ 60-80 и 20-30 ћелија нормалних пре имплантације миша ембриона доводи до развоја химерних ембриона у којем обележивачи тела сачињеним од донатора и прималаца ћелија, која нам омогућава да одреди улогу непознатих гена у гаструлација и органогенезе. Функционална мапа гена развоја мишева ембриона увећане детаље о улози гена сф-1 картици у надбубрежне жлезде и гениталне примордија, вт-1 ген - у бубрезима таб Миод породичне гене - на картици скелетног мишића генској фамилији гата-1-4 - у рестрикционим сазревања рудименти еритро- и лимфопоезе.

Дирецтед офф мајчиног и очинска алела гена у хЕСЦс користећи вектор рекомбиназу послужио да разјасне функције различитих гена током раних ембриогенеза и технологија циљања људских непознатих гена у мишјим ЕСЦ доприносе до открића нових мутираних гена одговорних за развој озбиљних наследних болести. Користећи метод кноцкоут дефинисано обавезује значај неких гена за полагање ембрионске ткива: гата-4 - фор инфаркта, гата-1 - то еритроидна хемопоиетиц ткива, Миод - скелетни мишић, брацхиури - за ограничавање мезодермом транскриптазе хнф3 анд хнф4 - фор јетре матичне ћелије, раг-2 - обележивачи за клонова Т и Б лимфоцита (Репин, 2001). Доубле брисање гена у хЕСЦс отворио приступ проучавању функционалне улоге гена ембрионалних слојева, сегментација и хомеосис и ЕСЦ трансплантацији дати могућност добијања одрживих интерспециес хибридних ембриона. Са побољшаним поступцима трансплантације донаторских ПГЦ у једној 8-целл ембриона доказано да цхимеризатион на ћелијском нивоу многих органа примаоца ембриона. Имајте на уму да се ћелија изданци налазе у ткиву органима људског примаоца мишева након давања хуманих хематопоиетиц матичних ћелија у бластоциста. Утврђено је да у миша ембрионима приликом формирања крвних органа циркулишу плурипотентне хЕСЦс. Могуће је да је њихова биолошка функција у ембрионалној организацији будућег имунолошког система. Са ЕСЦ ин витро репродуковати адекватне моделе људског генетског обољења: Доубле Кноцкоут моделима Дистрофин ген у мишева Душенова мишићна дистрофија, искључивања атм ген (контролни сигнал синтхесис киназа хроматина) - атаксија-телеангектазииу. У овом случају, фаталну наследна болест код деце услед грешака у репарацију ДНК развија дегенерације Пуркиње ћелија у мозак, који је праћен од стране инволуције тимуса због смрти пролиферативних ћелија. Цлиниц, Патофизиологија и патоморфологија Атакиа- телеангек- тазии добијени путем увођења у ЕСЦ абнормалне генетске информације из мишева химера одговарају онима код људи. Даље атакиа-телеангектазии користећи ПГЦ и мишеви развили експериментални модел, неки наследни хомозиготни људске болести повезаних са поремећајима угљених хидрата и метаболизма липида, катаболизма аминокиселина, уклањање бакра и билирубина, што значајно повећала могућност експерименталне медицине за преклиничкој тестирање нових метода за лечење релевантних обољења права.

[12], [13], [14], [15]

Употреба цитотихбрида матичних ћелија

Хибридни ћелије добијене спајањем соматске ћелије од хЕСЦс, адекватне и обећавајући модел за проучавање матичних ћелија плурипотенцију и репрограмирање диференцираних ћелија хромозома. Тситогибриди добијен спајањем ЕСЦ са диференцираним ћелијама животиња одраслих, пружају могућност да студирају однос генома различитих "старости": развија јединствену ситуацију у којој су хомологне хромозоми изведену из ћелија различитим фазама диференцијације, и различите степене зрелости су у истој једра, где се лако могу трансдеиствуиусцхими деле регулаторне сигнале је тешко предвидети како ће реаговати тсисрегулиаторние епигенетске систем хомологних хромозома постојећих током ин. Подељен развој, као одговор на утицај трансдеиствуиусцхих сигналима из ембрионалних сродних генома Надаље, у хибридним ћелијама се деси сегрегација родитељског хромозома који омогућава да проучавају интеракцију генома на одвојеним нивоу хромозома., тј потенцијално идентификује део специфичних хромозома у одржавању плурипотенцију или напротив, излаз у диференцијацији.

Као први експериментални модел за проучавање интеракције генома различитог "историји развоја" користе тситогибриди добијен спајањем тератокартсиномних плурипотентне и диференцираним соматских ћелија. У неким случајевима, такве хибридне ћелије задржавају плурипотентне особине на довољно високом нивоу. Конкретно, у виво соматски хибридним тератокартсиномно ћелије су индуковани развој правих тератомас деривате сва три герминативних слојева а ин витро у суспензији културе формираним ембриоид тела садрже. Чак иу овој врсти интерспецијес тситогибридов уочених присуство феталних антигена у случајевима у којима соматских партнер спајања са тератокарцином ћелијама били лимфоците или тхимоцитес. Важно је напоменути да су цито-хибриди створени фузијом ћелија тератокарцинома са фибробластима одговарали фибробластима према фенотипу.

Најважније је да у томе што у-тератокартсиномно соматске хибридни ћелија појавила знаке генома репрограмирање диференцираних ћелија, одликује реактивације појединачних гена или неактивно Кс-хромозома соматским партнера. Стога, резултати истраживања о тератокартсиномно-соматски ћелијама типа тситогибридах указују да хибридни ћелије често задржао плурипотенцију и репрограмирања генома, постоје знаци соматским партнера.

У експериментима добити ембрионалне унутарврсном хибридне ћелије фузијом ћелија слезине са животињом миша ЕСЦ одраслих студирао карактеристике су тситогибридов, анализу сегрегација родитељских хромозома и оценио плурипотенцију хибрид генома. За интерспециес хибрида ћелија које производе фузије тератокарцином ћелија са соматских ћелија, генерално карактерише низак сегрегације хромозома са тетраплоидних или скоро тетраплоидном кариотипом. Сличан хромозомски састав примећен је у цитотибриду фузијом примарних полних ћелија са лимфоцитима. Истовремено су интерспецифиц хибридне ћелије добијене као резултат спајања миша лимфоцита ћелије тератокартсиномних минк, дошло је до интензивног сегрегација хромозома соматске партнер.

У квалитативно нову фазу у проучавању сегрегације родитељских хромозома у интерспециес хибрида дошло након развоја микросателитима методе анализе коришћењем ланчане реакције полимеразе, при чему сваки миш хромозом пронашао неколико стотина маркере, омогућавајући поуздано разлику између било којег пара хомологне хромозома у хибридним ћелијама.

Спајањем ЕСК (користећи ХМ-1 ћелија недостацима у гипоксантинфосфорибозилтрансферази активности, 2н = 40, КСИ, изолован из бластоцист миша соја 129 / 01А) са слезине мишева цонгениц линије ДД / ц није примило скуп хибридних клонова морфолошки има сличност хЕСЦс. Сви клонови су изоловани на селективном медијуму у којем је могуће раст једино са активним ћелије гипоксантинфосфорибозилтрансферазои. Електрофоретска анализа је открила присуство свих клонова алелска варијанта гипоксантинфосфорибозилтрансферази Карактеристика мице ДД / ц. Користећи цитогенетичких анализа, утврђено је да су четири имали три хибридне клонови околодиплоидни сет хромозома. Оне готово тетраплоидна клон садржи две популације хибрида ћелија, од којих је једна била тетраплоидна и други, мањи - диплоидна.

Анализа микросателитских дозвољава да се дискриминише било који пар хомологне хромозома моусе 129 / 01А и ДД / Ц, у хибридним клонова са околодиплоидним сету показала да клонови дошло у два различита преференцијални елиминације аутозома соматским партнера. Већина Аутозомно клонови ХЕСС2 и ХЕСС3 имао маркери лине 129 / 01А, односно плурипотентне партнера. Изузетак је хромозом 1 анд И: клонови ХЕСС2 анд ХЕСС3, уз маркере ХМ-1 ћелије, малог броја маркера присутни соматске партнера. Ови резултати могу да одражавају непотпуно сегрегацију хромозома 1 и и соматске партнер иу складу су са цитогенетичких подацима који тризомија хромозома који се јавља у 30-40% ХЕСС2 и ХЕСС3 ћелијских клонова. ХЕСС4 цлоне разликовала значајно у хромозомалној саставу: многи Аутономни хромозом Овај клон пореклом из генома ЕСК (хромозоми 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 13, 14 и 17), али хромозоми 1, 9, 11, 12, 15, 16, 18 и 19 су представљени хомолога оба родитеља. Квантитативни однос микросателитских маркера ове хомологне хромозоми одговара приближно 1: 1. Ово је омогућило аутори да сугерише да један хомолог потиче из генома ЕСЦ а други - од диференцираних ћелија. У неким субклоновима клона ХЕСС4 посматрати само симболично присуство хромозома 18 и 19 соматске партнера. Резултати показују да су ћелије клонира ХЕСС4, поред сегрегацији хромозома соматске партнера, било укидање једног или оба хомолога из горе хромозома плурипотентне генома, односно било двостраног сегрегација хромозома оба родитеља - овај феномен је прилично необично, јер тситогибридов карактеристика сегрегацију хромозома онли један од родитеља.

Осим тога, после 20. Пасуса, сви клонови хибридних ћелија садрже само Кс хромозома маркера соматске партнера, то јест, у клонова је замењен Кс хромозома ЕСЦ на Кс хромозом соматске партнера. То потврђују подаци ин ситу хибридизације користећи ФИТЦ-означену сонду специфичну за Кс-хромозом миша: позитиван сигнал је детектован само на једном хромозому. Треба напоменути да је у ранијим фазама култивације (до 15. Пасуса), према цитогенетским подацима, у многим ћелијама било је два Кс-хромозома. Сходно томе, употреба селективног медија вам омогућава да манипулише хромозомски састав хибридног ћелије и усмерена одабрати клонови носе сингле хромозома соматске партнер ЕСЦ у позадини геному.

Као јединствена карактеристика генома тситогибридов локализациони родитељских генома у једном језгру, наравно, поставља питање одржавања својстава плурипотентних ембриона генома ЕСЦ-соматских хибрида ћелија у условима блиском контакту са геном диференцираних ћелија. Морфолошки, цитохбрид ЕСЦ и соматских ћелија подсјећају на родитељску линију ЕСЦ. Куалифицатион плурипотенцију показала да околодиплоидним сви клонови сету хромозома успели да формирају у суспензији културе ембриоид органа у којима деривати три слоја клица присутни.

Већина хибридних ћелија садржи ЕЦМА-7 антиген, маркер карактеристичан за ране ембрионе миша, а такође је имао и високу активност алкалне фосфатазе. Најупечатљивији подаци о високим плурипотентним особинама хибридних ћелија добијени су у експериментима како би се добио низ ињекцијских химера који укључују хибридне ћелије клона ХЕСС2. Анализа биокемијских маркера показала је да су потомци донорних хибридних ћелија пронађени у већини ткива химе. Због тога, хибридне ћелије добијене фузијом ЕСЦ и соматских диференцираних ћелија задржавају плурипотенцију на високом нивоу, укључујући способност формирања химера када се убаци у бластоцистну шупљину.

Клонови ХЕСС2 и ХЕСС4 значајно су се разликовали у саставу родних хромозома, али су имали сличне плурипотентне особине. Могло би претпоставити да плиурипотентноств "у хибридном геном манифестује као доминантан знак, али је могуће да нису сви ембриона генома хромозома су укључени у одржавање плурипотенцију. Ако је ова претпоставка тачна, може се очекивати да елиминација неких хромозома плурипотентне партнера из генома хибридних ћелија не прати промене у њиховом плурипотентне статус. У овом случају, анализа сегрегације родитељског хромозома у ембрионалних хибридним ћелијама ће омогућити да се приближи идентификацију хромозома одговорних за контролу плурипотенцију плодових ћелија.

Серов О. Ет ал (2001) фоунд међу 50 потомство добијеним од укрштања на химера са нормалних мишева, оне које би имале генотипа миша 129 / 01А, и носећи Кс хромозома ДД мишеве. Аутори виде разлог за то у смањењу плурипотенције у хибридним ћелијама под утицајем соматског генома. Алтернативно објашњење може бити негативан ефекат тризомије за неку неравнотежу аутозома и полних хромозома (КСКСИ примећено у ћелијама до 15. Пасусу) у хибридним ћелија на пролаз мејозе. Познато је да ћелије КСКСИ не могу проћи кроз мејозу и формирати гамете. Тризомије такође може да изазове смањење пролиферативног активности хибридних ћелија, што резултује селективну предност у развоју химера могу припадати у ћелије примаоца ембриона. Из овога следи да за адекватну процену плурипотентне потенцијала хибридних ћелија неопходних за добијање хибридне клонове са нормалном диплоидном сета хромозома.

У експериментима Серова О. Ет ал (2001) први демонстрирао могућност репрограмирања Кс хромозом у геному соматске ћелије хибридног ћелије. Овај закључак произилази из аутори анализирају експресију химера ХПРТ ген (Кс-цхромосоме маркер): присуство алалске варијанте ХПРТ ДД / ц мишева је откривена у свим анализираним ткивима химеран. Треба нагласити да након увођења хибридних ћелија у бластоциста шупљини тситогибриди спадају у не-селективним условима и очување Кс хромозома у геном хибридних ћелија значи да је постало облигаторни компонента свом геному и ничим га не дискриминише из И хромозома плурипотентне партнера.

Сумира резултате анализе интеракције соматске и плурипотентне ембрионалног генома у хибридним ћелијама, аутори закључују да, у одређеном тситогибридах плурипотенцију појављује као доминантна особина. Ген хибрид способан да самостално хромозома репрограмира диференциране ћелије, које, међутим, не искључује супротан ефекат на соматски генома плурипотенцију ембрионалних генома. У култивацији хибридних ћелија индукција диференцијације долази много чешће него у првобитној родитељској линији ЕСЦ НМ-1. Сличан ефекат се примећује иу формирању примарних колонија: многе примарне колоније ембрионалних хибридних ћелија разликују се у раним фазама формирања са великим губицима клона током њиховог селекције и умножавања.

Стога, тситогибриди спајањем ЕСЦ са соматских ћелија, упркос блиског контакта са геном диференцираних ћелија задржи плурипотенцију као јединствен карактеристици ембрионалног генома. Штавише, у таквим хибридним ћелијама могуће је репрограмирати појединачне хромозоме који потичу из дифузних ћелија. Остаје нејасно колико добро очувани плиу- рипотентние својства ембрионалног генома у хибридним ћелијама, посебно њихова способност да учествују у формирању герминативних линија химера. Због тога је потребно добити ембрионалне хибридне ћелије са нормалним кариотипом. У сваком случају, плурипотентне ембрионалне хибридна ћелије може бити прави модел за генетичку идентификацију хромозома укључених у одржавању плурипотенцију или њеног контроле као билатерална сегрегација родитељских хромозома потенцијално пружа такву могућност.

Није мање привлачно истраживање феномена који О. Серов и коаутори (2001) дефинишу као "хромосомско памћење". У хибридном геному хомологне хромозоми су два алтернативна конфигурације: хомологе соматских партнер једном претрпео диференцијације, док хомологе плурипотентне партнера, овај процес тек почиње. Стога, одржавање високих плурипотентне својства хибридних ћелија указује да "плурипотентне" конфигурације хомологуес ЕСЦ прилично стабилне хибридних геноме, упркос утицају трансдеиствуиусцхих фактора које произилазе из соматске партнера. Горе описане карактеристике репрограмирања диференцирана хомологна генома хромозома током развоја химера не искључују могућност да су први фазе формирања ин витро и култивисање тситогибридов задржавају свој статус стечено диференцијације ин виво. Према последњим подацима, при пренос ембрионалне хибридне ћелије у не-селективном медијуму у коме постоји интензивно само елиминације хромозоми соматске партнер, тј геном хибридних ћелија лако дискриминише хомолога после ин витро култури 10-15 пролаза. Стога, ембрионске хибридне ћелије представљају обећавајући експериментални модел за проучавање не само од основних својстава ембрионалног генома као плурипотенцију, али њене алтернативе - ембрионални диференцијацију.

Терапијска ефикасност трансплантације ембрионалних матичних ћелија

Пре анализе терапеутску ефикасност ЕСЦ трансплантације и њихови деривати сумирати горњу материјал. Феатурес ЕСЦ у смислу пуне имплементације ембриогенеза ин витро су недовољни због недостатака у овом предмету због одсуства месенхималне матичних ћелија које се јављају у телу аутономно и независно од хЕСЦс. Генетска потенција ЕСЦ-а је мања од генетског потенцијала зиготе, стога се она не користи директно за клонирање ембриона. Јединствени биолошки потенцијал хЕСЦс као јединих ћелија у којима се програми развоја распоређени потпуно досљедну примјену, налази примену у изучавању функције гена студија. Коришћење ЕСК носио декодира прве комбинације сигнала који активирају експресију раних и касних гена, кодирање за развој три слоја клица. Очување геном плурипотенцију на ЕСЦ ин витро што их чини јединственим алат за поправку регенерацију који може аутоматски да надокнади губитке ћелија оштећених органа и ткива. У идеалном хипотетичком реализацији може претпоставити да "... У трансплантацији донаторских ПГЦ у организам примаоца преносе компактно упаковане програме који под повољним условима су реализоване у изградњу нове ткани'7 способан" ... Ефективно интегрисана у тело примаоца као морфолошке, функционални и функционални. "

Природно, поштујући развој метода за монодиференцију ЕСЦ-а, почело је истраживање ин виво функционалне активности ћелија добијених ин витро из једног специјализованог клона. Пролиферантни ЕСО клон генерише популације мигрираних прогениторских ћелија које су заиста способне да активно интегришу у зоне збрињавања ткива примаоца, који се користи у регенеративној пластичној медицини. Утврђено је да трансплантација Допа-неурона у субстантиа нигра смањује клиничке манифестације у експерименталном хемипаркинсонијанизму. Регионалне трансплантације донорних неуроних матичних ћелија смањују степен моторичких поремећаја узрокованих траумом или контузијом кичмене мождине и мозга. Примљени и први позитивни резултати трансплантације матичних ћелија код демијелинозних обољења. Чини се да регенеративна-пластична потенција ЕСЦ-а отвара неограничене могућности за коришћење ћелијске трансплантације у практичној медицини. Међутим, када се трансплантира у ектопичне зоне, ЕСЦ се неизбежно претвара у туморе. Када се формирају субкутана ињекција ЕСЦ у имунодефицијентне тератоме мишева. Када се садње под капсуле суспендовања ЕСК тестиса у сингеним мишева је такође формиран тератомас састоје од различитих ткива, ћелије које су деривати сва три слоја клица. У таквим тератомима, процеси смањене органогенезе су изузетно ретки.

Бројни радови пружају информације о позитивним резултатима трансплантације раних деривата ЕСЦО-а животињама са експерименталном патологијом. Целл неуротрансплантатион употребом деривата ПГЦ је додатно развијен у експерименту и првих клиничких испитивања о корекцију функционалних поремећаја у мозгу и трауме кичмене мождине, третман Сирингомиелиа и мултипла склероза (Репин, 2001). Појавом технологије неироногенеза ЕСЦ ин витро, уместо коришћења ембрионалног можданог ткива трансплантације технике развијене деривате неуроспхерес добијене из култура ембриона нервно ткиво. Овакве суспензије трансплантације су много хомогене и садрже почињене неуроналне и неуроглијске прекурсоре.

Поред редовног медијума културе са ретиноичном киселином у дози од 10 уг / мл за 6 недеља на ембрионске линије (тератомас) НтЕра-2 хуман -картсиноми формирана преко 80% пост-митотских неурона. Комплетан хомогеност на неуронске популације се постиже протоком сортирање означене иммунопхенотипиц маркере зрелих неурона који може да се ослободи остатака тератокартсиномних и незрелих ћелија. Након трансплантације у различите регионе мозга експерименталних животиња, такви неурони не само да преживе, већ и уграђују у регионалне неуронске мреже. Код животиња са експерименталним моделима локалних дефеката ЦНС неуротрансплантатион смањује клиничке манифестације хуманој патологији попут ефеката краниоцеребралне трауме, шлога, демијелинизацијских болести, наследним церебралних развојних недостатака болести депозиције липида и полисахарида.

Да би се оптимизовали процеси регенерације дегенеративних болести централног нервног система, развијају се технологије за припрему олигодендроцита који производе мијелин. Прва фаза традиционално подразумева пролиферацију ЕСЦ-а са умножавањем броја ћелија неопходних за трансплантацију. У другој фази, извршена је усмерена диференцијација ћелија у популацију предурсора који производе микелин олигодендроците, а контролише се селективним маркер антигеном.

Неке изгледи су отворене за употребу деривата ЕСЦ да развију методе за корекцију имунодефицијенције изазване генетских дефеката у сазревања тимуса. У студијама у нокаутом (раг 1) мице витх индукованим генског дефекта - повреда рекомбинација мецханисм В (Д) Ј гена лоци ТЦР, што доводи до губитка функције Т-лимфоцити, трансплантације рани деривати ПГЦ у тимус животиње обнавља сазревање нормалних популација имуних клонова задужених за целуларни имунитет. Клиничко испитивање трансплантације пресоване ин витро хЕСЦс за лечење фаталну наследни анемију код деце.

Примедбе на брзом увођењу трансплантације матичних ћелија у клиници су оправдана ограниченог броја стабилних линија хуманих ембрионалних матичних ћелија и потребом за стандардизацију. Како би се повећала чистоћа стандардизованих ЕСЦ линија и одраслих матичних ћелија се предлаже да користи метод за избор линије на основу молекуларне генетске анализе схорт тандем ДНК понављања. Неопходан такође провери ЕСЦ линије за присуства малог хромозомских аберација и генетских мутација, потенцијал за појаву којих у условима ћелијске културе је прилично велик. Тхесис проширује обавезно тестирање особине свих врста ПГЦ и регионалних плурипотентних матичних ћелија, јер им простирање ин витро може довести до нових карактеристика није својствена ембрионалних матичних ћелија дефинитивно или ткива. Посебно, претпоставља се да дугорочна култивација у медијима са цитокинима Хесс ближе ћелије тумора, јер се јављају слични путеве промена регулишу ћелијски циклус са стицањем способности да спроведе неограничен број деоба ћелија. Неки аутори основу потенцијалног развоја тумора сматра лице рано трансплантација ембрионалног изведена матичних ћелија безобзирности. По њиховом мишљењу, много је сигурније да користе потомке почињених хЕСЦс, то јест, оснивачи диференциране ћелијске линије. Међутим, још увек није развијена поуздана техника за добијање стабилних хуманих ћелијских линија које се разликују у правом смеру.

Према томе, у литератури има све више података о позитивном терапеутском ефекту трансплантације деривата људских ембрионалних матичних ћелија. Међутим, многа од ових радова су предмет ревизије и критике. Неки истраживачи верују да су резултати раних клиничких испитивања прелиминарни у природи и само сугеришу да матичне ћелије могу имати благотворно дејство на клинички ток болести. Због тога је неопходно добити податке о дугорочним резултатима трансплантације ћелија. Као аргумент, дати су фазе развоја клиничке неуротрансплантологије. Заиста, у литератури, првобитно доминира објављивањем високе ефикасности можданог трансплантација фрагментима ембриона код Паркинсонове болести, али онда почеле да се појављују извештаји негирају терапеутску ефикасност ембрионални или феталне нервно ткиво пресађене у мозговима пацијената.

Спроведена прве клиничко испитивање процене безбедности трансплантације неуробласт - деривате ПГЦ НтЕра-2 тератокарцином, незреле ћелије које се размножавају у култури били изложени складиштење 100 милионити ћелијске масе. Део Тако добијени ћелија кориштена је за одређивање карактеристика фенотипа ћелије и нечистоћа, као и тестирање потенцијална контаминација вирусима и бактеријама. Из медијум за културу је уклоњен ЛИФ и напојног слоја стромалних ћелија и феталних створиле услове за усмерен диференцијације хЕСЦс у Неуробласти са комбинацијом цитокина и фактора раста. Затим су се неуробластови пречишћавали од ћелија незрелих тератокарцинома на сортеру тока кавеза. После другог пречишћавања и карактеризације фенотипа трансплантираних ћелија Неуробласти (10-12 милиона) суспенсион помоћу посебног шприца и мицроцаннулас стереотаки и под контролом ЦТ убризгава у нуцлеус басалису мозга пацијената (седмог месеца након хеморагичним можданим ударом). Одногодовои после трансплантације скрининг ефекте трансплантације неурона у строке зони открила никакве нежељене и нежељених ефеката. Половина болесника доживјела је побољшање у функцији мотора у периоду од 6 до 12 мјесеци након трансплантације. Позитивне клиничке промене су праћене повећањем прокрвљености можданог удара зони након трансплантације ћелија: средњег повећања апсорпције флуоресцентног-обележеног 2-деоксиглукоза према позитрон емисиона томографија достигао 18%, а код неких пацијената - 35%.

Међутим, Амерички национални институт за здравље је спровео независну студију о клиничкој ефикасности неуротрансплантације код пацијената са Паркинсонизмом. Пацијенти у првој групи били су трансплантирани ембрионским нервним ткивом који је производио допамин, док је друга група пацијената била подвргнута лажном операцији. Резултати указују на нулту клиничку ефикасност овакве неуротрансплантације, упркос чињеници да су ембрионални неурони који стварају допамине преживјели у мозгу прималаца. Штавише, након 2 године након трансплантације фетуса нервно ткиво у 15% пацијената развила сталну дискинезија, који је одсутан код пацијената у плацебо групи (Матичне ћелије: научни напредак и будуће истраживачке правце Нац пресуда, здравља САД ...). Посматрања даљег развоја болести код ових пацијената се настављају.

Неки аутори приписују контрадикторно литературу процену клиничких података ефикасност Неуротрансплантатион са другачијим приступом избора пацијената група, неадекватан избор објективних метода за процену њиховог стања и, што је најважније, различити услови развоја феталног нервног ткива и у различитим деловима мозга из којих тканина је произведена у различитим величинама трансплантације и методичких карактеристика операције.

Треба напоменути да покушава да управља трансплантација плурипотентних ембрионалних матичних ћелија у стријаталног региону мозга пацова са експерименталним телесном гемипаркинсонизмом пратњи ЕСЦ пролиферацију и њихову диференцијацију у допаминергичних неурона. Мора се претпоставити да су новоформиране неурони ефикасно уграђени у неурона мреже као ЕСЦ после трансплантације је примећено корекцију аномалија понашања и моторног асиметрија у Апоморфински тест. Истовремено, неке животиње су умрле због трансформације трансплантираног ЕСК у тумор мозга.

Стручњаци америчког Националног и медицинској академији, стручњаци Националног института за здравље верују да је клинички потенцијал хЕСЦс заслужује озбиљну пажњу, међутим, инсистирају на потреби за детаљним проучавањем њихових особина, вероватноће компликација и дугорочних ефеката у експериментима са одговарајућим биолошким моделима људских болести (стем ћелије и будућа регенеративна медицина Пресс Натионал Ацадеми, матичне ћелије и будући истраживачки правци., Нат. Инст, Хеалтх УСА).

Са ове тачке гледишта важно је упоредна хистолошка анализа експерименталних тератом добијен трансплантације у тестис вештачког ПГЦ са тератомас које су развиле због трансплантације раног ембриона, који је укључивао присутна ЕСЦ показала да ЕСК без обзира на њихово порекло или интеракције са од оних или других околних ћелија на исти начин реализују своје туморске можи. Показало се да такви тератомас имају клонској порекло, и од тумора ЕСЦ може доћи, који се састоји од деривата сва три герминативних слоја (.Рега, 2001). Важно је напоменути да када трансплантиране у имунодефицијентних мишеве клонираних ПГЦ са нормалном кариотипом и формирана тератомас се састоји од различитих типова диференцираних соматских ћелија. Ови експериментални подаци су савршени доказ клоналног порекла терата. Из перспективе развојне биологије, сугеришу да није више почињених родитељских ћелија и плурипотентне идентитета матичних ћелија је извор диференцираних деривата сва три слоја клица, Тератома компоненти. Међутим, у практични трансплантације ћелија Резултати ових студија су, ако не претерано, онда знак упозорења потенцијалне опасности, пошто инокулације ЕСЦ или првобитним герминативних ћелија у различитим ткивима одраслих имунодефицијентних мишева неминовно узрокује развој тумора из пресадјених матичних ћелија. Неоплазма дегенератион ектопичном пресађено ЕСЦ пратњи појавом сателитских популација диференцираних ћелија - делимично диференцира свакако ЕСЦ и прогениторне клонови линије посвећене. Занимљиво је да су трансплантације хЕСЦс у скелетних мишићних ћелија неар тератокартсиномними неурона чине чешће. Међутим, у вођењу ПГЦ Маце јаје или бластоциста праћено потпуној интеграцији у клице ћелијама без формирања неопластичних ћелија. У овом случају, ЕСК су уграђени у готово све органе и ткива ембриона, укључујући и сексуални рудимент. Такве аллофенние животиње су први добијен подвргавањем тератокарцином ћелију 129 у раним фазама ембриона у 8-100 ћелија. У аллофенних мишева популацијама гетерогеномних ћелија изведене донатора ПГЦ уводе у коштаној сржи, црева, коже, јетре и гениталијама, које омогућава да направите у експерименту чак интерспециес ћелија химера. Мања време раног ембриона, већи проценат ћелијске цхимеризатион, највишег степена цхимеризатион уочена у хематопоетског система, коже, нервног система, јетре и танког црева аллофенного ембриона. У организму одрасле ткиво подложни цхимеризатион заштићен од изложености имуног система на прималац гистогематицалкие баријера: трансплантација праисконско герминативних ћелија у тестисима паренхима пратњи уметањем донатора матичних ћелија у примаоца ткива герменативни слоју. Међутим, ЕСЦ трансплантација у формацију бластоциста химерних примордија гениталија са генерације донаторским примордиал герминативних ћелија се не дешава. ЕСЦ плурипотенцију приликом креирања посебних услова и може се користити за клонирање: ЕСЦ трансплантације мишеви 8-16-целл моусе ембриона, ћелије митозе где тситокалазином блокирани, доприноси нормалном ембриогенеза са развојем ембриона донатора ПГЦ.

Сходно томе, алтернативни је трансплантација алогенеичне ЕСЦ терапијског клонирања основу језгра соматске ћелије пресађивања у у без језгра јајне ћелије да створи бластоциста унутрашњу ћелијску масу из које се затим додељује линија генетски идентичних донаторских ПГЦ соматске нуклеус. Технички, ова идеја је изводљиво, јер је могућност стварања ХеСц линија из бластоцист добијених после трансплантације соматских језгара исувише без језгра јајне ћелије у више наврата показала у експериментима на лабораторијским животињама (Наги, 1990; Мунсие, 2000). Нарочито код мишева хомозиготних за мутације раг2, фибробласти добијени гајењем субепидермал ћелије ткива су коришћени као донаторска језгра су трансплантиране у без језгра ооцита. Након активације, ооцита "зигот" култивисане до стварања бластоциста, од унутрашњег ћелијске масе изолује ПГЦ и пролази их у линију за мутант гена нуллизиготних ћелија (раг2 ~ / ~). Хомологном рекомбинацијом у таквим ЕСЦ, коригована је мутација једног алелног гена. У првој серији експеримената из хЕСЦс рекомбинантног гена опоравио ембриоид тела су припремљена, трансфектоване ћелије соли са рекомбинантним ретровируса (ХокБ4и / ГФП) и након простирање код мишева убризган вена раг2 ~ / ~. У другој серији, тетраплоидни бластомери су агрегирани генетски модификованим ЕСЦ и трансплантирани на своје женске примаоце. Рођени имунокомпетентни мишеви служили су донаторима коштане сржи за трансплантацију на мутантне мишеве. У обе серије резултат је био позитиван: за 3-4 недеље пронађено је да сви зрели мишеви имају нормалне нормалне миелоичне и лимфоидне ћелије способне за производњу имуноглобулина. Стога, трансплантација у ооцита језгра соматске ћелије могу се користити не само за производњу ХеСц линија, али и за тситогенотерапии - Корекција наследних абнормалности користећи ЕСЦ као вектор за превоз исправљања генетске информације. Али у овом смеру трансплантације ћелија, поред биоетичких проблема, постоје и ограничења. Није јасно како безбедно трансплантација би терапеутски клонирати ћелија са генотипом идентична генотипу појединачног пацијента, јер такве ћелије могу увести мутације које стварају предиспозицију за одређене болести. Нормална људска јаја остану недоступни простор, а чак и када трансплантације соматске језгра у без језгра животињског јајне ћелије само 15-25% пројектован "зигот" развију до бластоциста фазу. Није одређено колико је бластоциста потребно за добијање једне линије плурипотентних клонираних ЕСЦ-ова. Требало би се запазити и висок ниво финансијских трошкова који су повезани са сложеношћу методологије терапијског клонирања.

У закључку, у ЕСЦ плурипотенцију генома хипометхилатед ДНК се комбинује са високим активношћу теломеразе и кратке фазе Ц ^ ћелијског циклуса, што осигурава интензиван и потенцијално бескрајну умножавање, током којих ПГЦ задржи диплоидна хромозоме и "малолетничког" скуп фенотипских карактеристика. Клонска раст ПГЦ у култури не спречава да диференцирају у некој специјализованој ћелију организма при пролиферацију а стоп линије и додавањем одговарајуће регулаторне сигнале. Ограничавање диференцијација хЕСЦс у складу ин витро соматске ћелије остварује без учешћа мезенхима, заобилазећи Нохтеиаов је органогенесис и без формирања ембриона. Ектопична ин виво примену ПГЦ неминовно доводи до формирања тератокарцином. ЕСЦ Трансплантација у бластоциста или почетком ембриона пратњи њихова интеграција са ткивима ембриона и њених стабилним цхимеризатион органа.

Регенеративне и пластичне технологије засноване на трансплантацији ћелија је тачка пресека интереса чланова ћелијске биологије, развојне биологије, експерименталне генетике, имунологије, неурологије, кардиологије, хематологије, и многим другим областима експерименталне и практичној медицини. Најважнији експериментални резултати доказују могућност репрограмирања матичних ћелија са правцем промене њихових својстава која отвара перспективу за сузбијање цитодифферентиатион процеса са факторима раста - за регенерацију миокарда, рестаурацију ЦНС лезија и нормализације функције острваца апарата панкреаса. Међутим, широко распрострањено деривати увод трансплантације ЕСЦ у медицинској пракси је неопходно истражити особина људских матичних ћелија на детаљнији и даље експерименте са ПГЦ у експерименталним моделима болести.

Биоетичких питања и проблем одбацивања алогене ћелија трансплантације може да реши посматрани пластичност генома регионалних одраслих матичних ћелија. Међутим, иницијална информација је да када трансплантације јетра изоловане и потпуно окарактерисани аутологне хематопоетске ћелије, од којих постоје нови хепатоцита, који укључују у хепатичних лобулес, сада разматра и критикују. Међутим, објављени подаци да је трансплантација нервних матичних ћелија у тимус је формирање нових изданака донаторских Т-и Б-лимфоцита, трансплантацију нервне матичне ћелије мозга у коштаној сржи доводи до формирања хематопоетског клица претрпео донатора мијелоидне и еритропоезу . Сходно томе, код одраслих органима може сачувати плурипотентне матичне ћелије способне да генома репрограмирање ЕСЦ на капацитет.

Људски ембрион остаје извор пријема ЕСЦ-а у медицинске сврхе, што предетерминира неизбежност новог пресека моралних, етичких, моралних, правних и верских проблема у тренутку рођења људског живота. Откриће ЕСЦ-а дало је снажан подстрек настављању оштрих дискусија о томе где се налази линија између живе ћелије и материје, супстанце и личности. Истовремено, не постоје универзалне норме, правила и закони у вези са употребом ЕСЦ у медицини, упркос поновљеним покушајима да их креирају и прихвате. Свака држава у свом законодавству сам решава овај проблем. Са своје стране, лекари из цијелог свијета и даље покушавају развити регенеративну пластичну медицину изван оваквих дискусија, првенствено кроз употребу не-ембрионалних матичних ћелија, као и резерви матичних ћелија одраслог организма.

Нека историја изолације ембрионалних матичних ћелија

Терато- (ембриона) ћелије се изолују из -картсиномние спонтано јављају тестиса тератомас сој миша 129 / тер-Св, спонтане јајника тератомас моусе линија Лт / Св, а од тератомас, ектопицхно соурце су трансплантиране ћелије или рани ткива. Међу тако добијених терато- стабилним мишу линија (ембриона) -картсиномних неким ћелијама плурипотентне, други су подвргнути диференцијације само у ћелијама једног одређеног типа, а неки су били генерално неспособни цитодифферентиатион.

У то време, фокус је био истраживање који показују могући повратак терато- (ембриона) -картсиномних ћелија у нормални фенотип после њиховог увођења у развоју ембриона ткиву је, као и радити на стварању ин витро генетски модификованом терато- (ембриона) -картсиномних ћелије, уз помоћ којих су мутирани мишеви добијени за биолошко моделирање људске наследне патологије.

За изоловање терато- линије (ембриона) је коришћен у климатизација -картсиномних ћелија суспензије културе. У култури терато- (ембриона) -картсиномние ћелија, као и ЕСЦ, расту да формирају ембриоид тела и захтевају да буду преведени линију обавезујући дисоцијације одржавање плурипотенцију на хранљиви слој плодових фибробласта или суспензији култивисања у кондиционираног медијима. Терато- плурипотентне ћелије (ембриона) - карцинома линија великих, сферични, имају високу активност алкалне фосфатазе, образац агрегата и способни су вишесмерном диференцијације. Када је уведен у бластоциста су обједињени са моруле, што доводи до формирања химерних ембриона, у разним органима и ткивима које деривати се налазе терато- (ембриона) -картсиномних ћелије. Међутим, велика већина таквих химерних ембриони умиру у материци, а у органима преживи химере новорођеним стране ћелије и ретко детектован са ниском густином. Истовремено учесталост тумора (фибросарком, рабдомиосарком, и другим врстама малигних отока и аденом панкреаса) нагло повећава, и неопластичних дегенерације често јавља иу матерници химерних ембриона.

Већина ћелија терапија-ембрион-карцинома у микро-окружењу нормалних ембрионалних ћелија скоро природно стиче малигне неоплатичке карактеристике. Сматра се да је иреверзибилни малигнитет услед активације прото-онкогена у процесу структурних преуређивања. Један изузетак су ћелијске линије ембриокартсиномнои ССТ3, тератом изведену из мишјег тестис (лине 129 / Св-тер), која показују висок способност да се интегришу у ткиво и органа фетуса без накнадног формирања тумора у химерних мишева. Деривати линије ћелија линије карцинома терапија код химерових мишева практично не учествују у формирању примарних гоноцита. Очигледно је повезана са високом фреквенцијом хромозомских аберација код већине терато- (ембрион) -картсиномних линија у којима ћелије посматраним као анеуплоидију или хромозомске аномалије.

Неколико стабилних терато- линија (ембриона) -картсиномних хумана ћелија је припремљен под лабораторијским условима, назначен плурипотенцију, високу пролиферативни активност и способност за диференцијацију у култури током раста. Конкретно, линија хуманих ћелија терапија-ембрион-карцинома НТЕРА-2 коришћена је за проучавање механизама неуронске цитодиференцијације. Након трансплантације ћелија ове линије у субвентикуларну регију предњег дела новорођенчади, примећене су њихове миграције и неуроногенеза. Било је чак покушава трансплантација неуронску терато- добијен култивисања ћелија (ембриона) -картсиномнои линија НтЕра-2, код пацијената са потезима, који, према ауторима, који доводе до клиничког побољшања болести. У овом случају малигнитета терато- пресађене ћелије (ембрио) примећени су -картсиномнои лине НтЕра-2 код пацијената са можданим ударом.

Прва линија недиференциране плурипотентних ембрионалних матичних ћелија мишева у раним 80-тих година прошлог века добио Еванс и Мартин, их избором из унутрашње ћелијске масе бластоциста - ембриобласт. Изоловане ЕСЦ линије су дуго времена сачувале плурипотенцију и способност да се разликују у различитим врстама ћелија под утицајем фактора специјалног медија културе.

Термин "ембрионална плурипотентне матичне ћелије" припада Лерои Стевенс да истрага утицаја дувана катран на учесталост развоја тумора скренуо пажњу на појаву спонтаног тестиса тератокарцином линеарне (129 / в) мишева из контролне групе. Тестиса тератокарцином ћелије су карактерише високом стопом пролиферације, и у присуству течности оставио у трбушној дупљи са формирањем спонтаног диференцијације неурона, кератиноцита, хондроцитима, кардиомиоцитима, као косе и коштаних фрагмената, али без назнака сређену цитоарцхитецтоницс прикладно ткива. Приликом садње у култури тератокарцином ћелијској порасла откачен за подлогу плурипотентних клонова и формирана ембриоид тела су затим угашена и подвргнуте спонтани распад Дисордерли диференцирају у неуроне, глиа, мишићним ћелијама и кардиомиоцитима. Стевенс утврдио да тератокарцином моусе 129 / в садржи мање од 1% ћелија способних да диференцира у различите специјализоване соматске линије, и сама разликовање зависи од фактора који утичу на њих (композиција перитонеалну течност, производи додато култури зрелих ћелија или ткива). Лерои Стевенсон претпоставка о присуству међу тератокарцином ћелија ембриона прогениторне сексуална ћелије заметка је потврђено: суспензија ембриобласт преимплантатион ембриона ћелија одраслих мишева ткивима формира тератокарцином и одвојена од њих чистих ћелијских линија након интраперитонеалне примене примаоцу животиње су диференцирани у неуроне, кардиомиоцитима и друге соматске клетки деривати сва три слоја клица. У експериментима ин виво трансплантације ЕСК (добијен из ембриобласт али не тропобласт) код мишјег ембриона у различитим фазама линијама 8-32 бластомера завршио рађања химерног животиње (без формирања тумора) у органима који детектује изданци донатора ткива. Химеризму је примећено иу линији полних ћелија.

Примарни прогениторне ћелије заметка изоловане из миш ембрион клицама пол, морфологији, имунолошке фенотипа и функционалних карактеристика у складу са хЕСЦс изведеним из тератокарцином Стивенсон и ембриобласт. Ат химера рођене после давања хЕСЦс у бластоциста, аллофенни Морфогенеза орган карактерише мозаика наизменичну донатора и примаоца структурних и функционалних јединице јетре, плућа и бубрега. У великом броју случајева забележено је формирање цревних крипта или лобула јетре, које се састоје истовремено од примаоца и донорних ћелија. Међутим, увек се остварује морфогенеза према генетичком програму врста чији је примаоц припадао, а химеризам је био ограничен само на ћелијски ниво.

Затим утврђено је да је пролиферација хЕСЦс без цитодифферентиатион он хранљиви слој изведен месенхималне ћелије (фетални фибробласти) јавља у присуству ЛИФ везивање у селективним хранљивој подлози која селективно обезбеђују само опстанак матичних и родитељских ћелија, док је огромна већина специјализованих ћелијских елемената умире. Уз помоћ ових техника је 1998. Године Јамес Тхомсон је издвојено пет имортализоване линија ембрионалних матичних ћелија из унутрашње ћелијске масе особе бластоциста. Исте године, Џон се Герхарт је развио методу за изоловање бесмртне ЕСЦ линије од сексуалног облаку четири-пет-недеље људских ембриона. Због својих јединствених својстава, за само двије године, ембрионалне матичне ћелије и матичне ћелије дефинитивних ткива већ су почеле да се користе у пракси регенеративне медицине и генске терапије.