Лабораторијска дијагноза туберкулозе

Туберкулоза је болест која се лако дијагностицира у савременим условима и научним достигнућима. Лабораторијска дијагноза туберкулозе је централна у другим дијагностичким методама, пре свега на Кс-зраке методе истраживања.

[1], [2], [3], [4],

Клинички тест крви

Код пацијената са туберкулозом, промене у општој анализи крви нису патогномоничне. Са ограниченим и неактивним облицима туберкулозе, еритроцит је хипохромичан у нормалној количини. Када масивне инфилтрата или казеоног пнеумонија, а преваленција казеоног лимфаденитис, специфичне интестиналних лезија, као и за велики плућа или постоперативног крварења и ноте еритхропениа мицроцитосис, олигохромазииу, полихромазииу. Макроцитоза, а нарочито поикилотситоз, се сусрећу много чешће, обично са тешком анемијом. Број ретикулоцитима у кораку туберкулозе компензовати креће се од 0,1 до 0,6%, а субцомпенсатед - од 0,6 до 1,0% и 1% карактерише декомпензованом ретикулоцити.

Када туберкулоза у неким случајевима може бити умерено Леукоцитоза (до 15 хиљада леукоцита.), Мање зрачења, који јавља у 2-7% болесника са ограниченим и једноставан процес јављају форми иу 12,5% - од деструктивне и прогресивном плућном туберкулозом .

Најчешће промене се јављају у формули леукоцита. Означити и релативну и апсолутну неутрофилију, умерену промену леукоцитне формуле лево пре промиелоцита. Мијелоцити су веома ретки у случају некомплициране туберкулозе. Повећање броја неутрофила са ненормалним зрна у хаемограм туберкулозе увек приказује трајање процеса: код пацијената са тешком туберкулозом готово све неутрофили садрже абнормалну зрна. Када туберкуларна епидемија престане, нуклеарни смен се релативно брзо приближава нормалном. Патолошка грануларност неутрофила обично траје дуже од других промена у хемограму.

Садржај еозинофила у периферној крви такође варира у зависности од фазе процеса и алергијског стања организма. Њихов број опада до анеозинофилииа код тешке и продужене појаве болести и обратно, повећава како ресорпцију инфилтратима и плеурални излив, као ране облике примарног туберкулозе.

Већина облика примарне туберкулозе прати лимфопенија, која се понекад примећује већ неколико година, чак и након ожиљака специфичних промена. Секундарна туберкулоза у фази ексацербације, у зависности од тежине процеса, може бити праћена нормалним бројем лимфоцита или лимфопеније.

Заузима посебно место одлучујући седиментација еритроцита Додатне тестове за процену туберкулозе процес (ЕСР) која вредност у процени процеса туберцулосис протока и идентификовање њихових активни облици. Повећање ЕСР указује на присуство патолошког процеса (заразни-инфламаторни, гнојни септички, хемобластосис, Ходгкин ет ал.), А индикативно је њене озбиљности, али нормални нивои ЕСР није увек показују одсуство патологије. Убрзавање еритроцита седиментације допринети повећању нивоа крви глобулина, фибриногена, холестерола, и смањи вискозност крви. Успоравање седиментације еритроцита је карактеристично за стања које прате хемоконцентрација, повећање садржаја албина и жучних киселина.

Хемограм код пацијената са туберкулозом се мења током лечења. Хематолошке смене брже нестају, што је успешнија терапеутска интервенција. Међутим, треба имати на уму дејство на хемопоезу различитих антибактеријских лекова. Често узрокују еозинофилију, у неким случајевима - леукоцитозу, а чешће леукопенију до агранулоцитозе и лимфоидно-ретикуларне реакције. Систематска хематолошка контрола и тачна анализа добијених података су од суштинског значаја за процјену клиничког стања пацијента, динамику процеса и ефикасност третмана.

[5], [6], [7], [8], [9],

Клиничка анализа урина

Са туберкулозом уринарног система, уринализа је главна лабораторијска дијагностичка метода. Можете посматрати леукоцитурију, еритроцитурију, протеинурију, хипоизостенурију, туберкулозну микобактерију, неспецифичну бактериурију.

Леуцоцитуриа - најчешћи симптом туберкулозе мокраћног система пре хемотерапије и нема специфичан само у изузетним случајевима, као што је комплетна облитерацијом лумен уретера. Нецхипоренко тест (одређивање броја леукоцита у 1 мл урина) помаже објективније процени степен леукоцитуриа нефротуберкулозе са, ау неким случајевима да га идентификује при нормалном урина. Међутим, мора се узети у обзир да се леукоцитурија јавља код акутног и хроничног пијелонефритиса, циститиса, уретритиса, бубрега и уретера.

Еритроцитурија. Као и леукоцитурија. Сматрају се једним од најчешћих лабораторијских знакова туберкулозе генитоуринарног система. Учесталост хематурије зависи од преваленце процеса, повећава се док се у бубрегу развија деструктивни процес туберкулозе. Еритроцитурија без леукоцитурије је типичнија за ране фазе бубрежне туберкулозе. Хематурија, која преовлађује преко леукоцитурије, важан је аргумент у корист бубрежне туберкулозе у њеној диференцијацији са неспецифичним пијелонефритом.

[10], [11], [12], [13], [14], [15], [16],

Биокемијски тест крви

Код туберкулозе, промене у неким биохемијским параметрима првенствено зависе од фазе процеса, компликација и различитих истовремених болести. Код пацијената са неактивном туберкулозом плућа и других органа, укупне протеинске и протеинске фракције крвног серума су непромењене и одређују њихов нормалан садржај.

У акутним облицима болести, као и уз погоршање и напредовање хроничних облика туберкулозе, коефицијент албумин-глобулин се смањује.

Ессентиал у процени функционално стање органског оштећења и јетре у туберкулозе и њене компликације је одређивање серумског укупног и директног билирубина, АСТ (АЦТ), аланин аминотрансферазе (АЛТ). Динамичко одређивање нивоа аминотрансфераза. Билирубин у лечењу туберкулозних пацијената, нарочито у тешким облицима, обавезна је компонента биохемијског прегледа пацијената са туберкулозом и врши се месечно.

Процена функционалног стања бубрега укључује одређивање серумског креатинина и израчунавање брзине гломеруларне филтрације према Цоцкцрофт-Гаултовој формули. Израчунавање брзине гломеруларне филтрације уз помоћ Реберговог узорка даје мање тачне резултате.

Главни циљ динамичких биохемијских студија код пацијената са туберкулозом је праћење тока процеса, благовремено откривање нежељених ефеката лијекова и адекватна корекција насталих хомеостатских поремећаја.

[17], [18], [19]

Примена биокемијских метода испитивања код екстрапулмоналне туберкулозе

Најзначајнији индикатор је садржај туберкулостеаринске киселине у биолошким течностима, али његова дефиниција је повезана са техничким потешкоћама (потреба за гасном хроматографијом и масеном спектрометријом).

Проспективно мерење активности аденозин деаминазе - ензим, одређен у течностима: синовијални, перикардни, асцити или спинални. Главни произвођачи аденозин деаминазе су лимфоцити и моноцити. Одређивање аденозин деаминазе активности у биолошким течностима олакшава дијагнозу туберкулозе синовитисом, туберкулозе лимфних чворова, туберкулозног менингитиса, туберкулозе серозити.

Неки биокемијски индикатори због њихове неспецифичности одређени су само у биолошким течностима, у близини фокуса лезије. Измерите ниво индикатора као одговор на субкутану или интрадермално убризгавање туберкулина (обично пре, и 48 и 72 сата након тога). Након тога, степен повећања нивоа маркера (у%) израчунава се у односу на почетни ниво.

Оптимално одређивање у урину активности органског специфичног ензима трансамидазе, чији изглед се примећује када су бубрези различите природе погођени. Истраживање трансамидиназе је оправдано само у условима субкутане ињекције туберкулина, како би се погоршао локални инфламаторни процес. Одређује активност трансамидина у урину на почетку и 24-72 сата након увођења 50 ТЕ туберкулина. Проширење ферментије за 2 пута и више допушта у 82% случајева да диференцира активну туберкулозу бубрега због погоршања хроничног пијелонефритиса.

Код туберкулозе женских гениталних органа, концентрације хаптоглобина и малоног диалдехида у крви се одређују у условима провокативног туберкулинског теста. Субкутано убризган туберкулин у дози од 50 ТЕ и 72 сата касније извршио је други биохемијски испит. У случају етиологије туберкулозе, степен повећања нивоа хаптоглобина није мањи од 28%, а ниво малондиалдехида је 39% или више. Такође се користи одређивање активности аденозин деаминазе у перитонеумској течности добијеној из Доугласовог простора. Панкат се поново испитује 72 сата након интрадермалне ињекције туберкулина у дозама од 0,1 ТЕ и 0,01 ТЕ у пројекцију унутрашњих органа гениталија на предњем абдоминалном зиду. У корист процеса туберкулозе, повећање активности аденозин деаминазе је 10% или више у поређењу са почетним.

Када је ока погођена, испита се фокална реакција која се јавља у оку као одговор на антигенску стимулацију. Нежељено је развити изразит одговор, праћено смањењем визуелних функција. Због процена минималних фокалних реакцијама често је тешко препоручити закључивање објектификације оријентисана паралелно са, и степена пораста серумског хаптоглобина или аденозин деаминазу.

Све биокемијске студије треба извршити заједно са другим методама.

[20], [21], [22], [23],

Истраживање система коагулације крви

Релевантност истраживања статуса згрушавања крви систему ТБ је проузрокована присуством већег броја пацијената са плућном туберкулозе хемоптизије или плућном хеморагија, као хемоцоагулатион компликације у оперативном лечењу туберкулозе. Осим тога, латентни ток интраваскуларне хемокагулације који природно прати туберкулозу утиче на ток болести и на ефикасност хемотерапије.

Код болесника са плућном ТБ преваленцом ексудативну инфламације компоненте посматраног пада крв антикоагулационе активности. Код пацијената са ниском преваленцом специфичног лезије у плућима са превласт продуктивне хемоцоагулатион интраваскуларне инфламаторну компоненту изражена благо. Код болесника са плућном туберкулозом са хемоптизу и плућном система хеморрхаге државне згрушавања крви се разликује: код пацијената са ниским губитком крви у висини гемоптое или одмах након његовог престанка постоји оштар пораст способности коагулације крви због тешке интензивирању тромбинообразованииа задржавајући повећану "структурни" згрушавање крви. Код пацијената са великог губитка крви примећено смањење згрушавања потенцијал на рачун спуштања концентрације фибриногена. Фактор КСИИИ активност, број тромбоцита. У фази хируршког лечења код болесника са ограниченим облика плућне туберкулозе са значајним повредама јавља систем хомеостаза. Пацијенти са распрострањеног процеса у извршењу пневмон- или плевропневмонектомии често развијају ДИЦ, који могу попримити облик "друге болести."

За праћење стања коагулације крви код болесника са плућна туберкулоза треба спровести одређивање активираног парцијалног тромбопластинског времена (Аптт), фибриноген, време тромбина, индекс протромбинског и време крварења и згрушавања време.

[24], [25], [26], [27], [28]

Хормонално истраживање

Савремена експериментална и клиничка опажања указују на присуство промена у хормонском статусу код специфичних туберкулозних инфламација плућа. Доказано је да корекција дисфункције од, хипофизе-штитасте системима хипофизе-адреналне и функцијом панкреаса у вези са анти-ТБ терапије доприноси активације фиброгенеза и поправке на одређеном упале локусу.

Функционална стање хипофизе-тхироид система суди садржаја у крвном серуму тријодтиронина (Т ₃ ), тироксин (Т ₄ ), хипофизе тироидни стимулишући хормон (ТСХ). Утврђено је да субклимчка хипотироидизам је детектован у 38-45% болесника са плућном туберкулозом, а најчешће је дијагностициран дисеминоване и фибрином-цаверноус форме процес. Под овим истим облицима најдраматичније смањене вредности и Т ₃ и Т ₄, а долази дебаланс ових хормона у форми повећања однос Т ₄ / Т _с.

Адренокортикалне функцију процењује нивоом кортизола у серуму крви и функцију ендокриног панкреаса - концентрацију имуно-реактивним инсулина. У акутној фази заразне болести, повећава се потреба за ендогеним кортизолом и инсулином. Хиперинсулинемија такође сведочи о инсулинској резистенцији ткива тела, која је типична за било који активни инфламаторни процес, нарочито специфичан. Одређивање глукокортикоидне функције надбубрежних жлезда са активном плућном туберкулозом омогућава откривање присуства хиперкортицизма код већине пацијената. Нормални нивои концентрације крви кортизола у болесника са заразног инфламације у акутном периоду треба сматрати као релативна неуспех глукокортикоидног функције коре надбубрега које могу послужити као основа за држање доза по адекватну замене терапије глукокортикоида.

Скоро трећина болесника са плућном туберкулозом може утврдити да је ниво инсулинемије у њима прилично низак и да се приближава доњој граници норме, док 13-20% посматра значајан хиперинсулинизам. И релативни хипо- и хиперинсулинизам су високи фактори ризика за развој кршења метаболизма угљених хидрата различитих степени. Ове промене у функционалној активности Б ћелија панкреаса захтевају редовно праћење гликемије код пацијената са туберкулозом и благовремену превенцију дијабетес мелитуса. Поред тога. Ово служи као додатно оправдање за експедитивност употребе физиолошких доза инсулина у комплексној терапији туберкулозе.

Уопштено, нижим нивоима тироидних хормона и њихову дебаланса хиперцортисолемиа и хиперинсулинизму највећи домета код пацијената са тешком току туберкулозе процеса, са екстензивном оштећења плућа и тешким симптомима туберкулозе интоксикације.

Микробиолошка дијагноза туберкулозе

Микробиолошка студије су потребне у идентификацији болесника са туберкулозом, верификације дијагнозе, праћења и корекцијом хемотерапије евалуацију резултата лечења, другим речима, од регистрације туберкулозе пацијента пре него што га уклоните из Регистра.

Сви епидемиолошки програми и пројекти засновани су на процјени броја бактеријских излучака, што се не може урадити без употребе лабораторијских метода за откривање туберкулозе код микобактерија. У истраживању тзв. Неорганизоване популације, проценат бактеријских освајача достиже 70 или више, што чини лабораторијске методе довољно ефикасним средством за идентификацију пацијената са туберкулозом међу овом популацијском групом.

Традиционалне микробиолошке методе за дијагностицирање туберкулозе су бактериоскопске и културне студије. Савремени методи разматрају култивацију микобактеријске туберкулозе у аутоматизованим системима, постављање ПЦР-а. Међутим, сви ови поступци обавезно комбинују са класичним бактериолошким методама.

Сакупљање дијагностичког материјала

Ефикасност лабораторијских студија у великој мери зависи од квалитета дијагностичког материјала. Усклађеност са правилима за прикупљање, складиштење и транспорт дијагностичког материјала и тачна имплементација алгоритма за оцењивање пацијента директно утичу на исход и обезбеђују биолошку сигурност.

За тестирање на туберкулозу користе се различити материјали. Због чињенице да ТБ логких- најчешћи облик ТБЦ лезија, основни материјал за истраживање размотри спутума и друге врсте одвојивим трахеобронхијално: уппер респираторних секрета тракта добијене после аеросол инхалације: бронхијалне испирања; бронцхоалвеолар ринсес; материјал добијен бронхоскопије, а интрапулмонално транстрацхеал биопсија из бронхијалних аспирата, ларинкса брисева, ексудата од рана и размазима сар.

Ефикасност истраживања се повећава ако се врши контролисана колекција материјала од пацијента. У ту сврху издваја се специјално опремљена соба или купљене специјалне кабине. Прикупљање материјала је опасан поступак, стога је неопходно сакупљати материјал за истраживање, поштујући правила инфективне сигурности.

Материјал за тестирање на микобактеријску туберкулозу се сакупља у стерилним бочицама са чврсто завртаним капицама ради спречавања контаминације животне средине и заштите прикупљеног материјала од контаминације.

Бочице за сакупљање дијагностичког материјала морају испуњавати сљедеће услове:

• морају бити израђени од материјала отпорног на ударце;
• лако се растопи током аутоклавирања;
• бити довољно запремине (40-50 мл):
• имају широк отвор за сакупљање спутума (пречник не мање од 30 мм);
• бити једноставан за руковање, провидан или прозирни, тако да можете проценити количину и квалитет узорка који се прикупља без отварања поклопца.

Да би се постигли оптимални резултати истраживања, морају се поштовати следећи услови:

• Прикупити материјал пре почетка хемиотерапије;
• материјал за студију мора се сакупљати прије јутарњег уноса хране и лијекова;
• за истраживање пожељно је сакупљати најмање 3 узорка јутарње флегме. Сакупљање спутума 3 дана узастопна;
• прикупљени материјал мора бити испоручен у лабораторију што је пре могуће:
• у случају када је одмах немогуће доставити материјал лабораторији, она се чува у фрижидеру на температури ваздуха од 4 ° Ц у трајању од највише 48 сати;
• Приликом транспорта материјала потребно је пажљиво пратити интегритет бочица.

Правилно сакупљени спутум је слуз или мукопурулентан. Оптимални волумен тестираног спутума је 3-5 мл.

Спутум се прикупља под надзором медицинског стручњака. Особе одговорне за сакупљање спутума треба да прате примену одређених правила:

• неопходно је објаснити пацијенту сврху студије и потребу да се излучи не слина или назофарингеална слуз, већ садржај дубоког респираторног тракта. Ово се може постићи резултат продуктивног кашља који се јавља након неколико (2-3) дубоких удисања. Такође је неопходно упозорити пацијента да треба испирати уста куханом водом, како би се уклонио главни дио микрофлора који расте у оралној шупљини и остатку хране који ометају испитивање спутума;
• медицински радник који учествује у сакупљању спутума, поред баде мантила и шешира, мора носити маску, гумене рукавице и гумени предпадник;
• стоји иза пацијента, препоручује се да боцу буде што ближе усним и одмах раздвоји у себи флегм док кашље, и мора се осигурати да је проток ваздуха усмерен даље од здравственог радника:
• По завршетку сакупљања спутума, здравствени радник треба пажљиво затворити бочицу са поклопцем и процијенити количину и квалитет сакупљене спутума. Затим је бочица означена и стављена у посебан бик за транспорт у лабораторију.

Уколико пацијент не производи шлајм, ноћ прије и рано ујутру на дан наплате материјала потребног да му дати искашљавање :. Извод из корена белог слеза (мукалтин), Бромхекине, Амброкол, итд - или применити иритирајући удисање користећи опреме инсталиране у просторији за прикупљање флегм. Материјал прикупљен на овај начин не подлеже конзервацији и треба га прегледати на дан сакупљања. Да би се избегло његово "убојство" у лабораторији у правцу, треба направити посебну ознаку.

Ако се микробиолошке студије не спроводе на овом постројењу, сакупљени дијагностички материјал треба централно испоручити у лабораторију, под условом да се материјал чува у интервалима између испоруке у фрижидеру или уз употребу конзерванса. Доставити материјал лабораторији у транспортне кутије, које се лако могу дезинфиковати. Сваком узорку треба обезбедити одговарајућу етикету, а целокупни део треба попунити пратећим обрасцем.

[29], [30], [31],

Начини и учесталост прегледа пацијената

На иницијалној, тзв. Дијагностици, прегледу пацијента за туберкулозом, потребно је испитати најмање 3 порцине спутума у трајању од 2 или 3 дана. Прикупљени под надзором медицинског особља, што повећава ефикасност микроскопије.

Примарни преглед за туберкулозу треба да обављају све медицинске дијагностичке установе здравственог система. Недавно су на основу клиничких дијагностичких лабораторија организовани тзв. Центри микроскопије, опремљени савременим микроскопима и опремом за заштиту од епидемије, како би се побољшала ефикасност почетног испитивања.

Код објеката против ТБ, користи се тест скрининга који укључује испитивање спутума или други дијагностички материјал за најмање 3 пута 3 дана. Током лечења, микробиолошке студије се спроводе редовно најмање једном месечно током интензивне фазе хематотерапије. На прелазу у фазу лечења, студије се спроводе мање често - са интервалом од 2-3 месеца, док се учесталост студије смањује на два.

Карактеристике сакупљања дијагностичког материјала за ванпуштичну туберкулозу

Феатуре патолошки материјал са ванплућне облика ТБ - Мицобацтериум туберцулосис ниској концентрацији у њој, што захтева више осетљивих метода микробиолошких истраживања, првенствено на техникама подлоге за засејавање.

Са туберкулозом генитоуринарног система, урина је најспособнији студијски материјал. Сакупљање урина треба урадити специјално обучена медицинска сестра.

Спољне гениталије опере водом сапуном или слабим раствором калијум перманганата. Спољно отварање уретре пажљиво се третира. У стерилној бочици сакупља се просечан део јутарног урина: код мушкараца, природно, код жена, користећи катетер. Урин из бубрежне карлице се сакупља у стерилним цевима са катетеризацијом једног или два бубрега, у другом случају - неопходно одвојено од сваког бубрега. Мала количина овог урина се центрифугира, седимент се испитује.

Код мушкараца, сперме, пункт тестиса, тајна простате се подвргава центрифугирању како би се добио талог. Са било којом локализацијом специфичног процеса у гениталној области код мушкараца, масажа простате може промовисати секрецију секрета који садрже микобактеријску туберкулозу.

Менструална крв код жена се сакупља сисањем или употребом капице Кафка. Добијени материјал се ослобађа од црвених крвних зрнаца, пере се дестилованом водом, након чега следи центрифугирање. Преципитат се испитује.

Распоређивања из цервикалног канала у материци сакупљена је у некој Кафки капацитету или капици, односно пожељно је акумулирати 1-2 мл патолошког материјала.

Материјал добијен оперативним интервенцијама на бубрезима, гениталијама. Са биопсијама, ожиљци из ендометрија, хомогенизују. Да би то учинили, ставља се у стерилан малтер и темељито разбија стерилне маказе. Овој суспензији се дода стерилни речног песка у висини његовој тежини, а затим долити 0,5-1.0 мл изотонични раствор натријум-хлорида и све је тритурисан све до пасте масе са додатком изотонични раствор натријум хлорида (4-5 мл). Тада се маса остави да се постара 1-1,5 минута, наднестар се испитује.

Туберкулоза костију и зглобова. Панкат (гнездо апсцеса) добијених стерилним шприцем се ставља у стерилна јела и одмах се испоручује у лабораторију. Стерилна пипета, претходно навлажена са стерилним изотоничним раствором натријум хлорида, узима 2-5 мл гњида, пребаци у боцу перлица и додати још 2-3 мл изотоничног раствора натријум хлорида. Бочица је затворена плутом и потресена у џокер-апарату 8-10 минута. Испитана је хомогенизована суспензија.

У фистулозним облицима остеоартикуларне туберкулозе узима се гној са фистуле. Велико пражњење се сакупља директно у епрувету. У случајевима леан цурење гноја фистула испране са стерилним изотонични раствор натријум-хлорида и испирања су прикупљене у епрувету, односно комада тампона импрегниран гнојем и упућени на анализу.

Хируршка Материјал добијен током операције на костима и зглобовима може састојати од гнојних-нецротиц маса, гранулација, Сцар, коштаног ткива синовијалних мембрана и остале материјале. Његов третман се врши, као код туберкулозе бубрега.

Микробиолошка студија синовијалне течности у 3% раствору натријум цитрата (однос 1: 1) ради спречавања коагулације врши се одмах након пункције.

Туберкулоза лимфних чворова. Такође се испитује гној, извучен током пункције лимфних чворова. Као гној апсцеса. Испитане су ткива лимфних чворова добијених током хируршких интервенција, биопсије, као и код других облика туберкулозе.

Истраживање масе столице на микобактеријској туберкулози је изузетно ретко, због готово тоталног недостатка позитивних резултата.

[32], [33], [34], [35], [36],

Мицобацтериум мицросцопи

Микроскопија спутума је релативно брза, једноставна и јефтина метода која треба користити у свим случајевима са сумњом на туберкулозу. Осим тога, ова студија се спроводи ради процене ефикасности хемотерапије и утврђивања опоравка или неуспјеха лијечења ако нема теста културе.

Користе се две методе микроскопског прегледа:

• метод директне микроскопије, када се рукав припрема директно из дијагностичког материјала;
• метод микроскопије седимента припремљеног од материјала обрађеног за деконтаминацију за културу.

Прва метода се користи у оним лабораторијама где се обављају само микроскопске студије (клиничке и дијагностичке лабораторије опште медицинске мреже).

Најбољи резултати микроскопског прегледа добијају се концентрацијом дијагностичког материјала (на пример, центрифугирањем).

Да би се открила микобактеријска туберкулоза са вероватноћом од 50% при извођењу микроскопије, 1 мл спутума треба да садржи више од 5000 микробних ћелија. Спутум пацијената са пулмонарним облицима туберкулозе обично садржи значајну количину бактерија брзо киселином, што им омогућава да се поуздано детектују бактериоскопијом. Дијагностичка осетљивост ове методе може се побољшати испитивањем неколико узорака спутума од једног пацијента. Негативан резултат бактериоскопског прегледа не искључује дијагнозу туберкулозе, јер спутум неких пацијената садржи мање микобактерија него што се може открити микроскопијом. Слаба припрема мокраће спутума може узроковати негативан резултат бактериоскопског прегледа.

Најчешћи метод за детекцију ацидобиолошких микобактерија у боји је боја према Тсиол-Нелсен. Метода се заснива на пенетрацији карболног фуксина у микробиолошку ћелију кроз мембрану која укључује слој воштаних липида, док истовремено грејање и јак рад једрења фенола. Накнадна промена боје са 25% раствора сумпорне киселине или 3% хлороводоничне киселине доводи до промене боје свих не-киселостних структура. Обојани елементи мрље се обојују са 0,3% раствора метилен плаве. Мицобацтериа не перципирају уобичајене анилинске боје, због чега су ацидобиће микобактерије обојене црвено-црвеним и другим микробима и ћелијским елементима - плавом бојом.

За брисева бојени Зиехл-Нелсену користе светлосни бинокуларну микроскопе уљем имерсионих сочива (90- или 100-струко повећање) и окулара у 7- или 10-струког увећањем. Истражите 100 поља вида, што је довољно за идентификацију појединачних микобактерија у размазу. У случају да је резултат такве студије негативан, за потврду се препоручује да погледате још 200 видних поља. Запишите резултате, показујући број откривених ацид-фаст бацилли (КУМ).

Поред ове технике, флуорохромови боје се користе за луминесцентну микроскопију, што омогућава постизање најбољих резултата. Употреба ове методе повећава ефикасност микроскопије за 10-15%. При лечењу микобактерија са луминесцентним бојама (аурамин, родамин, итд.), Ове супстанце се такође везују за воштане структуре микробиолошке ћелије. Када зраче обојене ћелије уз узбудљив извор светлости (одређени спектар ултраљубичастог зрачења), почињу да сијају наранџасто или светло црвено светло на црној или тамно зеленој позадини. Због високе осветљености и контраста видљиве слике, укупна увећања микроскопа могу се смањити 4-10 пута, видно поље се шири и време прегледа лекова се смањује. Поред тога, због много веће дубине поља, можете повећати удобност студије.

Када се флуоресценцна микроскопија користи за приказ истог подручја, мрља се троши значајно мање времена него са лаком микроскопијом боје Тсиол-Нелсен. Ако на радни дан микроскоп прегледа око 20-25 таквих мрља, онда помоћу флуоресцентне микроскопије може истовремено испитати више од 60-80 узорака. Искусни микроскопи знају да је бојење ћелија са мјешавином аурамина и рходамина на одређени начин специфично за ацид-фаст бацилли, који у овом случају изгледају као златне палице. Сапрофити су обојени у зеленкастој боји.

Друга важна предност методе флуоресцентног микроскопије - могућност откривања измењен Мицобацтериум, изгубила под утицајем неповољних фактора, укључујући интензивне хемотерапије, кислотоусотоицхивости имовине и није детектован у вези са овим бојења Зиехл-Нелсену.

Недостаци методе флуоресцентне микроскопије укључују релативно високе трошкове микроскопа и његовог рада. Међутим, у централизованим или другим великим лабораторијама, где оптерећење прелази норму 3 лабораторијског техничара који раде са три конвенционална микроскопа, јефтиније је користити један флуоресцентни микроскоп.

Бактериоскопске методе имају прилично високу специфичност (89-100%). Око 97% позитивних резултата добијених било којим методом микроскопије недвосмислено потврђују резултати сејања.

Треба напоменути да је приликом микроскопског испитивања мрља патолошког материјала немогуће утврдити врсте које припадају идентификованој микобактеријској киселој боји. Метод мицросцопи омогућава дати мишљење само о присуству или одсуству киселине у припреми микроорганизама, што се може објаснити постојањем у природи великог броја морфолошки сличне туберкулозним микобактерија комплексних резистентних микроорганизама нонтуберцулар киселине.

Резултати микроскопије се процењују у полуквантитативним јединицама.

Да би се упоредили резултати различитих метода микроскопије, уведени су емпиријски коефицијенти. На пример, да упоредити резултате брисева обојени флуоресцентним бојама, истраживање података светлосног микроскопа (1000 пута увећање), потребно је поделити број киселине брзе бацилима детектује микроскопом флуоресценције, одговарајући коефицијент ат 250-струког увећањем - до 10, 450 пута - на 4, са 630 пута - на 2.

Карактеристике микроскопије за ектрапулмонарну туберкулозу

Изводи се директна микроскопија, као и микроскопија млаза припремљених након обогаћивања, праћен бојом Тсиол-Нелсен или луминесцентним бојама. Директна микроскопија размаза је неефикасна због ниске концентрације микобактерија у материјалу, и стога је рационалније користити методе обогаћења. Најефикасније је центрифугирање. Ако је биолошки материјал је вискозан, центрифугирање се примењује уз истовремену топљење и хомогенизације материјала, која се врши коришћењем брзе центрифуга са центрифугалном силом од 3000 г и хипохлорита решења. Други методи обогаћивања, као што је микро флотација, тренутно се не користе због формирања биолошки опасних аеросола.

[37], [38],

Културни метод дијагнозе туберкулозе

Метода сетве или метода културе је осетљивија од микроскопије и има неколико предности у односу на друге. Омогућава детекцију неколико десетина живих микобактерија у тестираном материјалу и има велику дијагностичку вредност. Ово је нарочито важно када се испитује материјал из новооткривених или лијечених пацијената који ослобађају малу количину микобактерија.

У поређењу са микроскопијом, истраживање културе омогућава повећање броја ТБ болесника дијагностикованих за више од 15-25%, као и провјеру туберкулозе у ранијим фазама, када је болест и даље подложна лијечењу. Веома важна предност теста културе је могућност добијања узбуде култура која може бити идентификована и проучавана у погледу осјетљивости на лекове, вируленције и других биолошких особина.

Недостатак метода узгоја укључује њихово трајање (време чекања материјала достиже 10 недеља). Већи трошак, сложеност обраде дијагностичког материјала.

Принципи предавања третмана дијагностичког материјала

Конвенционалне микробиолошке методе се не могу користити у спровођењу студија о туберкулози. То је због чињенице. Да мицобацтериум туберцулосис расте веома споро, а већина клиничких узорака садржи брзо растуће гнојне и гнусне микроорганизме, гљиве. Њихов брз раст на богатим хранљивим медијима омета развој микобактерија и не дозвољава изолацију узрочника агенса туберкулозе, тако да се дијагностички материјал мора претходно сјести прије сјећења. Осим тога, микобактерије које се издају из пацијентових дисајних путева обично су окружене великом количином слузи, што отежава концентрацију. У том погледу, пре садеја спутума и других сличних материјала, њихово утапање, неопходна је деконтаминација.

Сви детерџенти и деконтаминати имају мање или више изражен токсични ефекат на микобактерије. Као резултат обраде, до 90% микобактерија може умријети. Да би довољно за микобактеријску становништва, штедећи потребу за коришћењем технике обраде који омогућавају, с једне стране, да спрече брзо растуће пиогених бактерије и труло, а са друге - за очување одрживости микобактерија присутних у материјалу.

У зависности од материјала, њен степен хомогености и загађења за претходну обраду коришћењем различитих деконтаминацију: спутума - 4% раствор натријум хидроксида, раствора трохзамесцхонного натријум фосфат 10%, бензалконијум хлорид, Трисодиум фосфат, НАЛЦ-НаОХ (Н-ацетил-Л-цистеин натријум хидроксид) у коначној концентрацији од 1% НаОХ, у урину и другим течним материјалима - раствор сумпорне киселине 3% за контаминираних узорака материјала масти садрже - раствора оксалне киселине до 5%. Поред тога, у неким случајевима се користе ензими, сурфактанти (детерџенти). Коришћење Твеен и других детерџената прати мања смрт микобактеријских ћелија (40-50% преживи). Међутим, могу се користити само за течне материјале. Највећа дистрибуција на свету била је НАЛЦ-НаОХ. Произведено у сетовима. Ова метода омогућава додељивање више од 85% популације микобактеријских ћелија. Деконтаминацију тканесодерзхасцхих материје теже погодити, јер је степен дисперзије материјала током хомогенизације тешко. На пример, лечење биопсија лимфних чворова често је праћено повећаном учесталошћу контаминације од стране ванземаљске флоре. У овом случају може се користити 1% етонијума.

Нехомогени материјал се хомогенизује стакленим перлама у присуству деконтаминанта. Течни материјал се пре центрифугира и третира само талог.

Технике сетве и инкубације

Након претходног третмана, материјал се центрифугира, чиме се преципитује микобактерија и повећава њихов садржај у седименту ("богатство муља"). Настали преципитат се неутралише и инокулира (инокулира) са густим хранљивим медијима или цевима са течним (семиликуид) медијима. Од остатка седимента припремају се мрља за микроскопски преглед. Техника сејања треба да спречи унакрсну контаминацију дијагностичког материјала.

За поуздану клиничку интерпретацију резултата микробиолошке студије потребно је поштовати следеће правило: студије микроскопа и културе морају бити изведене паралелно из истог узорка дијагностичког материјала.

Инокулиране цеви се постављају у термостат на 37 ^° Ц 2 дана у хоризонталном положају. Ово обезбеђује равномјерније апсорпцију материјала у медијум за културу. Након 2 дана, цеви се преносе у вертикалну позицију и херметички затворене гуменим или силиконским утикачима како би се спречило сушење посејаних материјала.

Усеви су инкубирани на 37 ^о Ц 10-12 недеља са редовног недељног гледања. За сваки преглед, снимљени су следећи параметри:

• период који је визуелно посматрао од дана сетве раста;
• стопа раста (број ЦФУ-а);
• контаминација усева од стране ванземаљске микробиолошке флоре или гљивица (уклањају се такве цијеви);
• недостатак видљивог раста. Цеви се остављају у термостату до следећег прегледа.

Нутријски медији

Различити хранљиви медијуми се користе за култивацију микобактерија; густо, полу течност, течност. Међутим, ниједан од познатих хранљивих материја нема особине које осигуравају раст свих микобактеријских ћелија. У вези с тим, препоручује се 2-3 хранљива медија различитог састава да се истовремено користе да би се повећала ефикасност.

СЗО препоручује окружење Левенстеин-Јенсен као стандардни медијум за примарну изолацију узрочника туберкулозе и за одређивање његове осетљивости на лекове. Ово је густо окружење јаја на којем се раст микобактерија добија на 20-25 дан након сјећења бактериоскопски позитивног материјала. Усјеви бактериоскопски негативног материјала захтевају дужи период инкубације (до 10-12 недеља).

У нашој земљи предложени Е.Р. Финн јаја околине Финн-ИИ. У томе се разликује, уместо Л-аспарагина, користи натријум глутамат, који покреће друге начине синтетизирања амино киселина микобактерија. Раст на овом медију се јавља нешто раније, а учесталост алокације микобактерија је 6-8% већа него у Ловенстеин-Јенсен медијуму.

Да би се побољшала ефикасност бактериолошке дијагнозе екстрапулмоналне туберкулозе, препоручљиво је укључити модификоване Финн-ИИ медије у комплекс хранљивих медија. Да би се убрзао раст, додатни натријум тиогликолат 0,05%, који смањује концентрацију кисеоника, додатно се додаје храњивом медијуму Финн-ИИ. Да би заштитили ензим из Мицобацтериум система токсични продукти липидне пероксидације у хранљивој подлози Финн-ИИ давана антиоксидант α-токоферола ацетата у концентрацији од 0.001 мцг / мл. Сакупљање дијагностичког материјала врши се у складу са стандардном процедуром.

У руским лабораторијама за борбу против туберкулозе користе се и друге модификације густих хранљивих материја; предложио Г.Г. Мордовиан нутриент медиум "Нев", развио В.А. Аницки хранљиви медиј А-6 и А-9 итд.

Због чињенице да у процесу хемиотерапије је оштећење различитим метаболичким системима ћелија микроба, неки микобактеријске становништво губи способност да нормално развије у конвенционалном хранљивом медијуму и захтева осмотски уравнотежену (или полу-течно) подлоге.

Оцењивање и снимање резултата сјемења дијагностичког материјала

Неки сојци и врсте микобактерија расте споро, раст се може појавити и до 90-ог дана. Број оваквих усева је мали, али то омогућава да се издрже у термостату 2,5-3 мјесеца.

Вирулентне културе мицобацтериум туберцулосис обично расте на густом јајном окружењу у облику Р-облика колонија различитих величина и врста. Колоније суве, нагубане, слонова, благо пигментисана. У другим медијима, колонија микобактеријске туберкулозе може бити влажнија. После курса хемиотерапије или током лечења могу се издвојити глатке колоније са влажним растом (С-обрасци).

Када се изолују усјеви, посебна истраживања се користе за разликовање микобактеријске туберкулозе од не-туберкулозних микобактерија и сапрофита отпорних на киселине.

Позитиван одговор се даје након обавезног микроскопског прегледа ожиљка Тсиол-Нелсен из одраслих колонија. У случају раста микобактерија у сузама, пронађени су светло црвени штапићи који леже појединачно или у групама које стварају кластере у облику филца или плетеница. Код младих културама, посебно изоловане дуготрајне лечења болесника са хемотерапије, микобактерије разликују експресованог полиморфизам, док присуство штапа облика, заједно са кратким, готово цоццоид или издуженим верзијама које личе мицелијум.

Стопа раста микобактерија је назначена следећом шемом: (+) - 1-20 цфу ин витро (скромна бактеријска излучивања); (++) - 20-100 ЦФУ ин витро (умерено бактеријско излучивање); (+++) -> 100 ЦФУ ин витро (обилно бактеријско излучивање). У лабораторијској дијагнози туберкулозе није довољно одговорити да ли је микобактерија откривена једним или другим методом. Имају детаљно разумевање обима и природе микобактеријске популације, његовог састава и својстава. Ови подаци нам омогућавају да правилно тумачимо стање процеса, планирате тактику и благовремено исправите третман.

У посљедњих неколико година, у циљу убрзања раста микобактерија, храњивих медија на бази агара са различитим адитивима за раст и кориштењем посебне мешавине гаса су предложени. За добијање раста микобактерија на овим медијима, током култивације створена је атмосфера са високим садржајем угљен-диоксида (4-7%). У ову сврху користе се специјални ЦО ₂ -ињектори. Међутим, најразвијенији аутоматизовани системи за узгој микобактерија: МГИТ-БАЦТЕЦ-960 и МБ / Бацт.

Један такав систем - МГИТ Систем (пораст микобактерије указује тубе), која се односи на развој високе технологије и намењен за брзо бактериолошке дијагнозе туберкулозе и Мицобацтериум подложности прве линије лекове, и неке лековима друге линије. МГИТ је фокусиран на употребу као део ВАСТЕС-960 уређаја. Микроорганизми се култивишу у специјалним цевима са течним хранљивим средством заснованим на модификованом Миддлеброок-7Х9 медијуму. Да би се стимулисао раст микобактерија и потиснуо раст екстензивне микрофлоре, примењен је МГИТ додатак за раст и мешавина ПАНТА антибактеријских лекова.

Раст микроорганизама се снима оптички. Базира се на флуоресценцији, која се јавља када се кисеоником конзумирају микобактерије током раста. На дну специјалне епрувете налази се флуорохромна боја која зависи од кисеоника и прекривена слојем силикона. Репродукција микобактерије доводи до смањења количине кисеоника у епрувети и смањење концентрације која изазива повећање флуоресценције, која постаје видљиво под зрачењем помоћу ултраљубичасте светлости цевима и аутоматски регистровани фотосензор уграђени апарата ВАСТЕС-960. Интензитет луминесценције евидентира се у јединицама раста (јединице раста ГУ). Подаци о расту се снимају на рачунару, где се могу аутоматски сачувати. Компјутерску анализу кривих раста може да пружи информације о присуству различитих Мицобацтериум базена, укључујући нонтуберцулар и такође помаже да процени својства раста микобактерија.

Као резултат времена појаве таквих система је значајно смањена микобактеријски раста, у просеку 11 дана ВАСТЕС-960 и 19 дана на МБ / Бацт до 33 дана на стандардном чврстом хранљивој подлози. Треба напоменути да ови системи захтевају високо квалификовано особље. Сеединг материјал за течне медије ће пратњи сетве он Ловенстеин-Јенсен медијуму, играјући улогу Ундерстуди у случајевима када други медији Мицобацтериум туберцулосис не дозвољавају раст.

[39], [40], [41], [42], [43], [44],

Одређивање осетљивости на лекове микобактерија

Одређивање спектра и степена осетљивости микобактерија на лекове против туберкулозе је од клиничког значаја, као и епидемиолошке процене ширења туберкулозе уз отпорност на лекове. Поред тога, праћење отпорности на лекове омогућује процену ефикасности програма туберкулозе у целини, чиме је интегрални показатељ перформанси свих компоненти активности против туберкулозе.

Множљивост и временски период осетљивости на лек:

• пре почетка третмана једном за одређивање стратегије и тактике третмана:
• када се изолују из оболелих култура из различитих материјала (спутум, БАЛ течност, урин, ексудати, течност итд.), испитују се сви изоловани сојеви:
• на крају интензивне фазе лечења у одсуству клиничке и радиолошке динамике:
• ако је неопходно променити режим лијечења у следећим случајевима:
  • одсуство мрља спутума;
  • ре-изолација културе после негативног уклањања спутума;
  • драстично повећање броја ЦМУ у брису након почетног пада. Познато је да су сојеви микобактерије туберкулозе, који су хетерогени у смислу осетљивости на лек, изоловани из материјала од пацијента са туберкулозом. Сензитивност сојева на лекове против туберкулозе може се разликовати у опсегу лекова, степена, учесталости и брзине појаве отпора.

Степен резистенције на лекове Мицобацтериум туберцулосис је одређена у складу са утврђеним критеријумима, које су фокусиране на клинички значај и стабилност зависе од активности анти-ТБ лекова, његовим фармакокинетике, концентрације у лезије. Максималну терапијску дозу и тако даље.

Одређивање осетљивости лекова микобактерија тренутно се врши микробиолошким методама:

• Апсолутне концентрације (метод разређивања на густом или течном хранљивом медију),
• пропорције,
• коефицијент отпора.

Обично стабилност манифестује као визуелно приметног раста колонија Мицобацтериум туберцулосис, али постоје технике које индукују ране фазе раста у поделу ћелије Мицобацтериум у облику реакције боја. Ове методе скраћују време теста од 3-4 до 2 недеље.

Као што је уједињена у Русији је продужен, препоручује СЗО одбора хемотерапије метод апсолутне концентрације, која је са методолошке тачке гледишта, је најједноставнији, али захтева високу прецизност и стандардизацију лабораторијских процедура. Тест осетљивости на лек састоји се од скупа епрувета са хранљивим средством модификованим анти-ТБ лековима. Комплет се састоји од 2-3 цеви са различитим концентрацијама сваког од лекова користи, једна контролише цеви без лека на животну средину и једна епрувета која садржи 1000 мцг / мл натријум Салија тсиловокислого или 500 уг / мл паранитробензоинои киселине нонтуберцулар за детекцију раст микобактерија.

Да би се припремио сет медија са препаратима, коришћен је модификовани Левенстеин-Јенсен медијум (без скроба), који се улије у боцице. У свакој од бучица се додаје специфичан волумен одговарајуће разблажења антитуберкулозне припреме. Садржај бочица се темељно меша, улије у цеви и преклопи у нагнутом положају током 40 минута на температури од 85 ° Ц. Препоручује се навијање медија у електрични преклопник са аутоматском регулацијом температуре. У среду са лековима против ТБ

1-та серија може се складиштити у фрижидеру на 2-4 ° Ц у трајању од 1 месеца, са препаратима другог реда - не више од 2 недеље. Чување медија са препаратима на собној температури је неприхватљиво. При изради раствора лекова против туберкулозе узимају се у обзир њихова активност, израчунавајући концентрацију прилагођену молекуларној тежини неспецифичног дела препарата, чистоће итд. Да би се утврдила осетљивост на лек, користе се само хемијски чисте супстанце.

Принцип методе је да одреди концентрацију антитуберкулозног лека који инхибира раст значајног дела популације микобактерија. Ако се исправно уради, овај метод има добру поузданост.

Прије теста, неопходно је осигурати да изолована култура микобактеријске туберкулозе нема ванземаљску микрофлору. Из културе микобактерија у 0,9% раствору натријум хлорида припремљена је хомогена суспензија која садржи 500 милиона микробних тијела на мл (стандард оптичке турбидитета од 5 јединица). Добијена суспензија се разблажи са 0.9% раствором натријум хлорида (1:10) и додаје се 0,2 мл густине у сваку епрувету сета медија за културу. Инокулирана Епрувете су постављене у инкубатор на 37 ° Ц и држан у хоризонталном положају 2-3 дана на косог површини материјала је равномерно инокулисане са суспензијом Мицобацтериум туберцулосис. Цеви се затим преносе у вертикалну позицију и инкубирају 3-4 недеље. Резултати се снимају након 3-4 недеље.

Јер тајминг агента пуштања из клиничког материјала на хранљивим подлогама чинити најмање 1-1,5 месеца осетљивости лека могу се добити овим методом није раније него након 2-2.5 месеци после садње материјал. Ово је један од главних недостатака методе.

Интерпретирајте резултате одређивања осетљивости на лекове микобактерија на основу одређених критеријума. На медијима чврстом културу сматра осетљива на концентрацију лека која је садржана у медијуму, ако је број колонија микобактерија гајених ин витро са овим леком није више од 20 са обилним растом у контролној епрувети без лекова. Само у присуству више од 20 колонија је култура која се сматра отпорном на ову концентрацију. У пракси, када добијање раста резултира у тестним цевима близу 20 цфу. Потребно је обавестити клиничку јединицу да је осјетљивост или отпор у овом случају гранична, јер понекад може објаснити нејасну динамику клиничких индикатора.

За различите лекове утврђена је одређена концентрација, на којој се примећује репродукција критичне пропорције популације микобактерија. Ове концентрације се зову "критичне". Као критеријум стабилности користи се раст популације микобактерија на хранљивом медијуму са препаратом у критичној концентрацији.

У домаћој пракси ТБ, у одређивању отпорности на лекове, они нису ограничени на одређивање само критичних концентрација. То је због чињенице. Да је ниво проширена дефиниција резистенције на лекове омогућава лекару да прецизније позиционирање хемотерапију тактику користећи знање потенцира дејство комбинације лекова, укрштају очекује отпор или да примењују ефикаснији групу лекова који се користе против лекове.

Апсолутна метода концентрације је најједноставнија, али је и најосјетљивија на грешке направљене када се изврши. Више поузданији, нарочито у одређивању осетљивости на лекове друге линије, и заједнички ван Русије, је начин пропорције. Узима се у обзир недостаци методе апсолутних концентрација, али у извршењу је теже.

Метода је веома слична апсолутној методи концентрације. Припрема епрувета са лековима врши се на исти начин. Као у методи апсолутне концентрације. Међутим, доза семена суспензије микобактеријске туберкулозе се смањује за фактор од 10. Што елиминише учесталост спонтаног отпора неких сојума микобактеријске туберкулозе таквим лековима као што су Етамбутол, протионамид, капреомицин. Као контрола, користе се 2 или 3 епрувете са дозом семена једнаке у епрувете, узастопно разблажене 10 и 100 пута. Критеријум стабилности је проценат визуелно посматраног раста микобактеријске туберкулозе. За лекове прве серије, критеријум стабилности је вишак раста од 1% почетне популације, за лекове другог реда - повећање од 1 или више од 10% почетног, у зависности од изабране критичне концентрације.

Године 1997. Је радна група СЗО и Међународне уније за идентификацију добра туберкулозе резистенције ТБ лекова учинила прилагођавања овим критеријумима, нудећи отпоран микобактерије сматра, која расте на добар медија јаје Ловенстеин-Јенсен при следећим концентрацијама:

• дихидрострептомицин - 4 μг / мл;
• исониазид 0,2 μг / мл:
• рифампицин 40 μг / мл:
• Етамбутол - 2 μг / мл.

2001. Године су предложене критичне концентрације за следеће лекове друге линије (за критични проценат од 1%):

• капреомицин - 40 мцг / мл;
• протионамид - 40 мцг / мл;
• канамицин - 30 μг / мл;
• виомицин - 30 мцг / мл;
• циклосерин 40 μг / мл;
• аминосалицилна киселина - 0,5 μг / мл;
• офлокацин - 2 μг / мл.

Резултати раста се процењују након 4 недеље као прелиминарне и након 6 недеља гајења - као последња.

Да би се одредила осетљивост лека на пиразинамид, која се широко користи у савременој хемиотерапији за туберкулозу, препоручена критична концентрација је 200 μг / мл. Међутим, до сада не постоји опћенито прихваћена метода за утврђивање резистенције на лек за овај лек на чврстим хранљивим медијима, јер се његова антибактеријска активност манифестује само у киселом медију (пХ <6), што је технички тешко одржати. Поред тога, многе клиничке културе микобактерија туберкулозе нерадо расте у јајима у окружењу са киселим окружењем.

Да би се проценио квалитет резултата испитивања осетљивости лека Мицобацтериум, препоручује се да сваки нови серије средње Љ контролишу паралелну одређивање осетљивости стандардног музеј сој Х37РВ. Поред тога, постоје и одређени микробиолошки критеријуми који се морају одржавати тако да технике дају добро репродуковани и правилно интерпретирани резултат. Ово укључује одрживост културе Мицобацтериум туберцулосис, правила за добијање хомогена суспензија и суспензије култура правила селекције Мицобацтериум туберцулосис, репрезентативности изабраног бактеријске масе. Поузданост одређивања отпорности на лек смањује се са изузетно оскудним бактеријским ослобађањем.

Недавно се сматрао методом за одређивање сензитивности лека помоћу аутоматизованих система. Најсавршеније у овој области су развој заснован на ВАСТЕС МГИТ-960. У овом случају, сензитивност лијекова микобактерије туберкулозе се одређује на основу модификоване методе пропорција. У процесу одређивања, упоређује се стопа раста микобактеријске туберкулозе у контролној цеви и епрувете са лековима. Да би се одредио осетљивост на стрептомицин, изониазид, гребен-питсину и етамбутол се користи обогаћивање адитива и антибиотика укључена у сет сире кит. Да бисте одредили осетљивост на пиразинамид, користите комплет ПЗА. Током Тест вешања Мицобацтериум туберцулосис инокулисане епрувете са лековима, као контролне цеви са реконституисаног суспензију 100 пута за све лекове осим пиразинамид, при чему суспензија представља разблажење 10 пута. Критеријум стабилности је показатељ раста микобактерија од 100 ГУ када се раст постигне у контролној цеви 400 ГУ (погледати "Методе културе за изолацију микобактерија"). Рачунање и тумачење резултата се врши аутоматски и подешава се помоћу улазног или изабраног програма.

Као критичне концентрације, коначне концентрације се користе у епрувети са течним хранљивим средством. Тренутно су развијене критичне концентрације за лекове прве линије и другу линију. Треба напоменути да се сензитивност микобактерије туберкулозе на циклосерин и аминосалицилну киселину одређује само на хранљивим хранљивим материјама.

Детаљан протокол рада на описаном систему омогућује проучавање осјетљивости на лијек и на изолованој култури (са густим хранљивим средством) и примјеном примарног раста микобактерија у МГИТ цеви. Ова друга опција значајно смањује време за културу, омогућавајући вам да добијете комплетне резултате културе Мицобацтериум туберцулосис (укључујући информације о осетљивости лека) после 3 недеље од датума наплате материјала, док традиционални начин је могуће добити само 3 месеца. Временом, добијени резултати, када је пацијент у интензивној фази лечења, могу компензовати релативно високу цену истраживања.

[45], [46], [47], [48], [49], [50], [51],

Диференцијација микобактерија

Узимајући у обзир да коришћени хранљиви медији нису строго селективни. Накнадна диференцијација изолованих микобактерија је препозната као обавезна. Потреба за диференцијацију микобактерија је због бројних карактеристика патолошких процеса изазваних рода: различитог току и исходу туберкулозе и мицобацтериосис, присуство резистенције природног лека на неке антитуберкулотицима.

Познато је да је примарна идентификација Мицобацтериум туберцулосис комплексног М. Нонтуберцулар из микобактерија врши по следећим карактеристикама: стопа раста на чврстим хранљивим медијумима, пигментације, колонија морфологији, присуству киселог отпора и температуре оптималан раст.

Нажалост, не постоји јединствена лабораторија начин да поуздано разликовање М. Туберцулосис сложену микобактерије са других киселине брзо бацила, ипак комбинација карактеристика претходно описаних резултатима ниже наведених бројних биохемијских тестова омогућава идентификацију Мицобацтериум туберцулосис комплекса са М. Вероватно до 95%.

За диференцијацију Мицобацтериум комплексног М. Туберцулосис (М. Туберцулосис, М. Бовис, М. БовисБЦГ, М. Африцанум, М. Мицроти, М. Цанеттии и други) са спорим растуће микобактерија користи нонтуберцулар основне биохемијске тестове који детектују присуство следећих симптома:

• способност производње никотинске киселине (тест ниацина):
• активност нитрата редуктазе;
• термостабилна каталаза;
• раст на медијуму са натријум салицилатом (1 мг / мл).

Као додатни тестови, може се користити и раст на медију који садржи 500 μг / мл паранитробензојеве киселине или 5% натријум хлорида.

Многе бактериолошке лабораторије идентификују ове микроорганизме само на нивоу комплекса, што је последица ограничених способности лабораторија и методолошких способности специјалиста.

У већини случајева, међутим, у пракси за разликовању М. Туберцулосис и М. Бовис довољно следећи тестови: ниацин, присуство нитрата, регистрације присутности и пиразинамидази раста у медијуму који садржи 2 уг / мл хидразид тиофен-2-карбоксилне киселине. Узима се у обзир да микобактерије комплекса М. Туберцулосис карактеришу следећи скуп карактера:

• спор раст (више од 3 недеље);
• температура раста у опсегу 35-37 ^о Ц;
• одсуство пигментације (слоноваче);
• обележена киселом бојом;
• позитиван тест ниацина;
• позитиван тест нитратне редуктазе;
• одсуство термостабилне каталазе (68 ^° Ц).
• Одсуство раста на медијуму Левенстеин-Јенсен који садржи:
  • 1000 μг / мл натријум салицилата,
  • 500 μг / мл паранитробензојеве киселине,
  • 5% натријум хлорид:
• раста у присуству 1-5 μг / мл тиофен-2-карбоксилне киселине.

Релевантност диференцијације изолованих микобактерија ће се значајно повећати с повећањем учесталости регистровања случајева ХИВ / АИДС-а повезаних са туберкулозом или микобактеријом. Тренутно не постоји апсолутна сигурност спремности практичних регионалних лабораторија да правилно изврше овај обим посла.

[52], [53], [54], [55], [56], [57], [58], [59]

Имунолошка дијагноза туберкулозе

Постоји низ универзалних феномена, лекова и имунолошких тестова који су првобитно били пронађени управо са туберкулозом или моделом имунолошког одговора на микобактерије. Ово укључује БЦГ туберкулин, такав феномен као кожног ДТХ (туберкулин - Пиркует и Мантоук реакција), реакција на поткожним туберкулинских сензибилисане животиња (Коцх феномен). Једно од првих антитела у заразној болести такође је откривено код туберкулозе. Наравно, дубље разумевање добрих механизама туберкулозе имунитету и њихова генетска контрола, већи може бити употреба имунолошких метода и лекова који утичу на имуни систем, у решавању практичних проблема ТБ.

Најважнији и тешки практични проблем се тренутно сматра откривањем туберкулозе у процесу масовног скрининга становништва. Међутим, упркос бројним извештајима о "успесима" (на ограниченом материјалу), не постоји одговарајући имунолошки метод (поновљив у "било које оружје") и лек који је погодан за ту сврху.

Имунолошке методе, нарочито серолошке студије (одређивање антигена, антитела) и тестови који изазивају туберкулин, веома се користе у клиничкој пракси.

На првом месту међу имунолошким испитивањима коришћеним у диференцијалној дијагнози постоје серолошке методе - одређивање антигена и антитела у различитим срединама тела.

Специфичност антитела на туберкулозу микобактерије зависи од антигена који се користе у имуноассаиу. Предложена је значајна количина антигена, од којих је прва туберкулин ППД:

• ПАП и други сложени препарати из течности културе;
• ултразвучна дезинтеграција;
• Екстракт Тритон и други комплексни препарати ћелијских зидова;
• 5-антиген (Даниел);
• 60-антиген (Цоццито);
• липоарабиноманнан;
• корд-фактор (трехалоза-6,6-ди-миколат);
• фенолни и други гликолипиди;
• липополисахариди;
• антиген везујући фибронектин;
• протеини (најчешће рекомбинантни); 81.65,38,34,30,19,18,16,15.12 ЦДА, итд.

Као резултат вишегодишњег истраживања руских и страних научника открила основне законе и ефикасност антитела серолошком дијагнозе туберкулозе: комплекснију антигена, додатно побољшана осетљивост и нижи специфичност теста. Специфичност у различитим земљама зависи од становништва заразе М. Туберцулосис и нонтуберцулар микобактерија из ношење БЦГ вакцину и друге. Код деце информације садржај серодијагностиковање је нижа него код одраслих. Код примарне туберкулозе (чешће деце), дефиниција ИгМ је информативнија. Са секундарним ИгГ. Код ХИВ-инфицираних пацијената информативна вредност серодијагнозе код одређивања антитела је смањена. Одређивање Ефикасност антитела зависи од броја "клиничким аспектима": процес активност (присуство или одсуство "изолације" микобактерије присутност распадања шупљина, степен инфилтрације), преваленца процеса, трајање његовог тока.

Осетљивост методе ензимског имуноассаиа (ЕЛИСА) је око 70%. Недовољна ефикасност студије је због ниских специфичности. Раније је разматрана могућност коришћења серолошког скрининга у високо ризичним групама, посебно међу особама са променама после туберкулозе у плућима.

Како би се побољшала специфичност ЕЛИСА настави потрагу за још специфичних антигена, укључујући и оне произведене генетским инжењерингом (. Види горе) Есат-6 и други .. Употреба стриктно специфичних антигена (38 кДа, ЕСАТ) повећава специфичност. Али значајно смањује осетљивост анализе. Уз (нпр Патхозиме ЕЛИСА кит екпериментал лабораторијским тестних система.) ИФА такође обезбеђује комплете са латералном иммуноцхроматограпхиц филтрацијом (Мицодот), као и друге сличне тестови (дот-анализу на мембрани) са визуелне процене резултата теста. Током ових тестова, анализа се проводи 10-30 минута; они не захтевају специјалну опрему, они захтевају визуелну процену резултата, који је повезан са одређеним субјективитетом. Ове методе имају приближно исте карактеристике осетљивости и специфичности (70% и 90-93%, респективно) као традиционални ЕЛИСА.

Употреба метода имунолошке анализе има одређену вриједност као додатну, која се узима у обзир у комплексу кориштених метода у диференцијалној дијагнози туберкулозе, посебно у дијагнози његових екстрапулмоналних облика. Најефикаснија ЕЛИСА метода је у дијагнози туберкулозног менингитиса у проучавању цереброспиналне течности. У овом случају, сензитивност анализе је 80-85%, а специфичност је 97-98%. Постоје подаци о ефикасности откривања антитела на туберкулозу микобактерије у течном флуиду у дијагнози туберкулозног увеитиса.

Индукција гама интерферон синтезе ин витро

Гама интерферон (ИФН-γ) је специфичан фактор имунолошке одбране који се реализује активирањем ензимских система макрофага. Индукција ИФН-γ синтезе сензибилизованим Т-лимфоцитима узрокује њихову интеракцију с антигеном микобактерије.

Као антигени који се користе као туберкулин ППД. А специфични антигени, добијени генетским инжењерингом, посебно антигена ЕСАТ-6 (еарли лучи антиген који има молекулску масу 6 кДа) и ЦФП 10 (култура Филтрат протеин 10 кДа). Генетски инжењеринг или рекомбинантни антигени су одсутни у ћелијама БЦГ вакцине и других микобактерија. Када се користи туберкулин, резултати индукционог теста ИФН-γ су упоредиви са резултатима теста коже туберкулина (директна корелација). Када се користе генетски конструисани антигени, резултати испитивања су специфичнији и не зависе од претходне вакцинације БЦГ-а. Приликом тестирања вакцинисаних особа које нису имале контакт са инфекцијом туберкулозе, специфичност теста је 99%. Сензитивност теста код пацијената са туберкулозом варира од 81 до 89%.

Тестови и дијагностичке алатке су развијени на основу краткорочног култивацију ћелија или ћелија цела крв мононуклеарних изолованих из крви са антигена Мицобацтериум туберцулосис ин витро са накнадном одређивање концентрације ИФН-и или бројањем Т-лимфоцита које синтетишу ИФН-и. Концентрација интерферона синтетисана у епрувети се одређује помоћу ЕЛИСА помоћу моноклонских антитела која везују ИФН-γ. Затим, калибришући стандардни ИФН-γ, његова концентрација се одређује у епрувети или бунарима плоче.

Код извођења Елиспот теста, број Т-лимоцита синтетизира ИФН-γ. Се рачунају на површину плоче обложене антителима са ИФН-γ.

Програмери Диагностицум на ИФН-γ ин витро индукцијом, који је одобрен од стране Агенције за лекове и америчких производа тврде да тест није могуће направити разлику између латентне ТБ инфекције од активне туберкулозе. Према томе, у регионима са високим нивоом инфекције, тест није директно дијагностички. Међутим, у нашој земљи се може користити за диференцирање инфекције туберкулозе код дјеце од алергије после вакцинације и процјене нивоа специфичног имунитета у процесу лијечења.

Тренутно се испитивају домаћи тест систем за одређивање индукције ИФН-γ синтезе специфичним антигеном туберкулозе ин витро.

Имунски статус и ток туберкулозе, имуноокоррекција

У процесу лечења туберкулозе код људи, постоје промене у антигенемији и стању имунолошког система.

Подаци о променама у ексудатима и ткивима су у великој мери контрадикторни. Једино што се може приметити са добрим разлогом је то што се код туберкулозних гранулома, по правилу, открива значајан број активираних Т-лимфоцита.

Има смисла да се задржимо на још две одредбе које су неопходне за разумевање улоге имунолошких механизама у лечењу туберкулозе код људи:

• Пацијенти са АИДС-ом имају посебно високу учесталост резистенције на више лекова;
• са вишеструком отпорношћу на лекове (иу одсуству ХИВ инфекције), посебно су значајни поремећаји имуности (посебно веза Т-ћелија).

Када туберцулосис широко примењују различите методе имуномодулацију: управо лекови који делују првенствено на имунитету Т-ћелија и систем мононуклеарних фагоцита (тимуса хормони, изофорон, ликопид, полиоксидони ет ал.). Као и целокупне (атенуиране) микобактерије и њихове компоненте.

Молекуларно-биолошка дијагноза туберкулозе

За методама молекуларне биологије у дијагностици заразних болести укључују, углавном методе на бази манипулисање геномске материјалом бактеријских и вирусних патогена идентификовати специфичне генетски материјал - ДНА сегмената који имају нуклеотидну секвенцу специфична за одређену сојевима типа или патогена за анализу специфичне ДНК секвенце у геномима који одређују осетљивост патогена на одређене лековите супстанце, а такође и за функционалну анализу активност одређених гена патогена. Техникама молекуларне биологије су широко у научна истраживања и практичне примене у дијагностици и праћењу различитих бактеријских и вирусних инфекција након отварања 1985. Године, Царрие Миуллисом (добитник Нобелове награде. 1989) полимераза ланчане реакције.

Принципи и могућности методе ланчане реакције полимеразе

ПЦР дозвољава да се ин витро амплицира нуклеотидна секвенца (ДНА фрагмент патогена) неколико сати у милионима пута. Реакција у присуству појединачних ДНК ланаца одређује изузетно високу осјетљивост теста.

Нуклеотидна секвенца одређених региона у ДНК ланцу одређује генетски идентитет микроорганизма, што објашњава високу специфичност ПЦР-а.

Вредност ове технике за детекцију и истраживање карактеристика изазваних Мицобацтериум туберцулосис биолошких карактеристика микроорганизма имају врло успорен раст: удвостручење времена Мицобацтериум туберцулосис ДНК када култивисања је 12-24 сати.

Принцип ПЦР методе се састоји у амплификацији - вишеструким, милионима пута. Множећи секције специфичне секвенце ДНК у мицроволуму цеви током цикличног понављања следећих три фазе реаговања, од којих свака пролази у другом температурном режиму:

• Фаза И - денатурација двоструке ДНА код загревања са дивергенцијом његових ланаца;
• ИИ степен - комплементарно везивање (хибридизација) прајмера (примарни олигонуклеотиди) са терминалним деловима ланаца строго специфичних, изабраних за умножавање фрагмента ДНК;
• Фаза ИИИ - завршетак ланца фрагмента ДНА помоћу термостабилне ДНК полимеразе.

За амплификацију ин витро, морају бити молекули матрице ДНК. Четири врсте деоксинуклеозид трифосфата (нуклеотида) који садрже одговарајуће азотне базе: аденин (А), тимин (Т), гуанин (Д), цитозин (Ц); вештачки синтетизовани приминг олигонуклеотиди (прајмери) који се састоје од 18-20 базних парова; термостабилна ДНК полимераза ензим има температурну оптимална 68-72 ^о Ц и магнезијум јона.

Специфичност ПЦР зависи од избора фрагмента ДНК. У складу с тим, синтетишу се бочни олигонуклеотиди семена. Специфичност хибридизације и завршетка ланца ДНК се заснива на принципу комплементарности следећих парова азотних база: аденин-тимин, гванин-цитозин.

Да бисте утврдили геномска туберкулозе микобактерија комплекс најефикасније мета амплификације у већини тест системима одабраних ДНК фрагмент ИС6110, који у већини сојева Мицобацтериум туберцулосис генома има значајан број (10-20) понављања, који обезбеђује, уз специфичности, високом осетљивошћу теста. Истовремено су описани соји Мицобацтериум туберцулосис са малим бројем понављања или одсуством фрагмента ИС6110.

Изолација молекула ДНК из биолошког узорка

За спровођење ПЦР, молекули ДНК патогена треба изоловати из биолошког материјала у минималном запремини, са минималном количином неспецифичне ДНК и различитим инхибиторима ензимске ДНК полимеразе.

Припрема узорака треба обавити под условима који спречавају унакрсну контаминацију узорака изолованим молекулима ДНК. Да би то учинили, предодређење собе са ултраљубичастим, подовима и радним површинама столова и уређаја је неопходно за растворе који садрже хлор. Такође се обавезно користи чисте рукавице, пробне цеви за једнократну употребу и савети за аутоматске пипете.

Мин до изоловали ДНК Мицобацтериум туберцулосис из клиничких узорака (цереброспинални течности, бронхијална прање) не садржи велики број ћелија, ћелијске остатке, или њихове соли, довољан за центрифугу узорка на 3-4 хиљада., Додати муљ 20-30 ул 2% раствора тритон Кс-100 и загрејана на 90 ^око Ц током 30 мин.

За припрема узорака спутума мора бити ефикасан ликвефакција, која се углавном користи за раствор натријум хидроксида и Н-ацетил-Л-цистеин (НАЛЦ) 4% у количини од 50-80 мг по узорку - зависно од узорка вискозности. НАЛЦ раствор се мора припремити ек темпоре или НАЛЦ прах може се директно додати сувом у узорак. Након течности, узорке треба центрифугирати 15 минута на 3.5-4.000 обртаја у минути (3000 г) у 50 мл епрувете са завртњима, тј. Под истим условима који се препоручују за припрему препарата флегма.

За екстракцију ДНК из методе пелета најчешће користи на основу употребе 5-6 моларног раствора гундин изотиоцијанат лизу реагенса као и микропорозних честица и силицијум оксида ( "дијатомејска земља") сорбинг ДНК молекул. Неспецифичне супстанце, укључујући инхибиторе могуће, онда оперу у 2,5 моларног раствора гванидинијума изоцијаната и етанол, након чега се молекул ДНК десорбује у води, и ових узорака користе за обављање ПЦР. Да би се поједноставила технологија екстракције ДНК, "дијатомејска земља" се често замењује магнетним микрочестима обложеним силицијум-оксидом. У овом случају, уместо центрифугирања користи се посебан магнетни држач за микротубове ради преципитације честица.

У Русији је развијен изворни метод за имуномагнетно одвајање микобактерија, праћен екстракцијом ДНК патогена. За Мицобацтериум туберцулосис имуномагнетног сепарације користећи ферропартицлес величине 3-5 микрона, обложено силике, за који су прикачени помоћу хемијских веза поликолоналних (кунић) антителима на Мицобацтериум туберцулосис. Узорци спутума након алкалне лизе неутралишу се киселим раствором трис-ХЦл и инкубирају имуномагнетним сорбентом. Затим, имуноферо-честице се сакупљају помоћу магнетног штапа са замјенљивим врхом, преносе се у микротубе и преципитирају. Додати 20-30 μл 2% Тритон Кс-100 раствора и загрејати 30 минута на 90 ^° Ц. Супернатант се користи као ДНК шаблон за ПЦР анализу.

Тешки проблем је изолација ДНА микобактерије туберкулозе из биопсијских узорака. За биопсију ензима, ензимска протеиназа К се користи при коначној концентрацији од 200-500 мг / л на температури од 56 ^° Ц преко ноћи. Надаље, користи се једна од познатих метода. Прекомерна неспецифична ДНК у ПЦР анализи биопсија често узрокује инхибицију реакције, која захтева поновну екстракцију ДНК.

Методе за откривање резултата

После завршетка реакције, амплификовани ДНК фрагменти патогена су идентификовани различитим методама.

Метода гел електрофорезе је добро позната. Овако добијени фрагмент ДНК идентификовани су позитивна контрола садржи жељени специфичан фрагмент ДНК или позната претходно величини (број базних парова) фрагменту који је утврђено стандардном молекуларном маркером.

У присуству специфичне боје, етидијум бромид је укључен у двоструку ДНА. Синтетизовани ДНК фрагмент се детектује као опсег светлост под дејством ултравиолетног.

Величина ДНК фрагмента, одређена електрофорезом са удаљености од почетка, мора одговарати познатом маркеру молекулске тежине или позитивној контроли.

Друге методе одређивања ПЦР резултате на основу хибридизације једног ланца ПЦР производи са олигонуклеотида комплементарног њега - ДНА пробе обележити биотином, затим откривањем преко ензимске реакције, на пример везивање за стрептавидин-биотин алкална фосфатаза.

На основу овог типа откривања, створени су ПЦР анализатори у којима се детекција ПЦР резултата извршава аутоматски као резултат читања оптичке густине у узорцима након манифестације ензимске реакције.

Недостаци ових метода су могућности интралабораторне контаминације прилично кратким фрагментима молекула ДНК. Када молекули уђу у нове узорке, постају матрица за ПЦР и доводе до лажних позитивних резултата.

У том смислу, како би се спријечили лажно-позитивни резултати, уведена су строга правила за одвајање и изолацију просторија: извлачити ДНК из биолошких узорака; просторије за детекцију резултата (електрофорезе) из чисте зоне. Ови простори су зона вероватне контаминације. Још једна изолована површина је чиста просторија за увођење узорака ДНК које треба испитати у цевима са реакционом смешом за ПЦР. Коначно, претпоставља се да главни уређај - ДНК појачало - треба ставити у засебну, можда канцеларију, просторију.

Да би се спречило контаминацију производа из претходних реакција - неки Ликон-амп ПЦР тест систем уместо дезоксинуклеозидтимидина садржати дезоксинуклеозидуридин који при витро синтезом круг уместо инкорпорирана у правилан положај, тј, Нитрогенска база тимина присутна у изворној ДНК замењена је урацилом. Урацил-ДНА гликозилаза, додата у реакциону смешу у анализирани материјал, уништава само фрагменте загађивача са деоксиуридином, али не и изворну ДНК која се анализира. . Накнадно загревање на 94 ^° Ц инактивише овај ензим и не омета амплификацију у ПЦР.

Постоји систем испитивања који се заснива на изотермичкој амплификацији рРНК, за коју се први пут спроводе реверзна транскрипција и синтеза молекула ДНК. Што је, пак, матрица за накнадну синтезу молекула РНК. Ампликони РНК се детектују помоћу сонде обојане ДНК сонде када се хибридизује у раствору реакционе цеви. Ова метода, поред високе осетљивости, има предност анализе у једној цеви, што спречава контаминацију. Према ауторима, сензитивност ове методе у респираторним узорцима достиже 90% са специфичност од 99-100%.

Нове методе откривања се имплементирају у ПЦР-у у реалном времену. Ови поступци се разликују првенствено у том ПЦР-у и откривање његових резултата истовремено се одвија у једној затвореној цеви. Ово не само технолошки поједностављује технику анализе, већ и спречава контаминацију лабораторијских просторија и тестова узорака са производима претходног ПЦР-а.

У реалном времену резултате ПЦР детекцију је због флуоресценцију јавља током флуорогеног хибридизације сонде ДНК са амплифитси Руи-ПЦР током одређеног ДНК фрагмента. Структура Флуорогени ДНА пробес конструисан тако да маркер флуоресцентни ослобађа као резултат ензимске реакције или удаљене од молекула флуоресценције гаси само под специфичну хибридизацију са жељеним ДНК молекула који се умножене током ПЦР. Како број сонде молекула хибридизују са порастом флуоресценције је пропорционалан откривеном ниво броја молекула амплификованог производа. Јер у сваком броју циклуса ПЦР фрагмент ДНК молекулу је множи пола, број циклуса при коме флуоресценције одређује и повећава обрнуто пропорционална броју ДНК молекула у почетном узорку. Ако је реакција да уведе као калибровсика неколико различитих познатих концентрација молекула одговарајућих фрагмент ДНК Мицобацтериум туберцулосис, коришћење рачунарског програма може се израчунати и количина геномске ДНК у испитног материјала.

Сваки стандардни узорак се дуплира. Квантитативни критеријум је минимални број ПЦР циклуса потребних за почетак и раст одређене флуоресценције. На абсциси - број циклуса; ордината је вредност флуоресценције. Концентрације ДНК су обратно пропорционалне броју циклуса потребних за појаву флуоресценције. У десној колони (21-32) означени су бројеви циклуса за одговарајуће концентрације. Разлике између 10-кратних концентрација фрагмената ДНК 10 ² -10 ⁶ мл - 3.2-3.4 циклуса. За два пацијента, концентрације ИС6110 фрагмената су биле око 10 ³ / мл и 10 ⁴ / мл. Узимајући у обзир број понављања (6-20) фрагмената анализираних у геному Мицобацтериум туберцулосис, број мико-бактерија у клиничким узорцима је око 100 и 1000 ћелија, респективно.

Коришћење ПЦР у дијагнози туберкулозе

Метода ПЦР се најчешће користи за убрзану дијагнозу туберкулозе - откривање микобактеријске туберкулозе у клиничким узорцима: спутум. Бронхијалне испирање, плеурални ексудат, урин, церебралне течности, пунцтатес остеолизу, женске аспирати гениталног тракта и биопсија другачије. У студији у Холандији око 500 спутума и бронхијална Промивка самплес фром 340 пацијената са потврђеном дијагнозом плућне туберкулозе су проучавани да се упореди осетљивост ПЦР метода микроскопије и студија културе размаза. Сензитивност анализе била је 92.6.88.9 и 52.4%, респективно. Специфичност свих метода била је око 99%.

Упоређена је ефикасност детекције микобактерије туберкулозе микроскопијом микроскопа, сјемања на Левенстеин-Јенсен медијум, ВАСТЕС тест система и ПЦР анализе. ПЦР је показао сензитивност од 74,4%, микроскопија - 33,8%, сејање на густом медију - 48,9%, а ВАСТЕС - 55,8%. Просечно време детекције за сејање на Левенстеин-Јенсен медијуму је 24 дана. ВАСТЕС - 13 дана, ПЦР - 1 дан.

Дискутоване су и могућности коришћења ПЦР као осетљивог и брзог метода за праћење ефикасности лечења туберкулозом.

Детекција Мицобацтериум туберцулосис ДНК помоћу ПЦР са ефикасном хемотерапијом утврђеном у дужем временском периоду - у просеку 1.7 месеци у поређењу са бриса дефинисаним под флуоресцентним микроскопом, а за 2,5 месеци у поређењу са бактериолошког испитивања.

Дијагноза екстрапулмоналних облика туберкулозе

Вредност као осетљив ПЦР методе је посебно велика за ванплућне облике, јер формира под тим клиничким и радиографски методи конвенционалним бактериолошких метода за одређивање Мицобацтериум туберцулосис у дијагностичким материјалима неефикасне.

У истрази узорака урина ПЦР резултати су били позитивни у 16 од 17 пацијената са активном ТБ и негативним уринарног 4 болесника неактивног бубрежне туберкулозе и 39 болесника са уринарном нонтуберцулар система болести.

Ефикасност ПЦР анализе у проучавању аспирација коштане сржи код пацијената са грозницом непознатог порекла приказана је у случајевима сумње на туберкулозу. Да би се дијагностиковала туберкулозни лимфаденитис, 102 дјевојчице проучавале су аспирације за пробушење и биопсијски узорак од 67 дјеце са сумњивим туберкулозним лимфаденитисом. Добијени су позитивни резултати: 71,6% ПЦР у реалном времену. Флуоресценцијска микроскопија - 46,3%. Истраживање културе - 41,8%. У испитивању 50 биопсија лимфних чворова код пацијената са болешћу мачака, сви резултати су били негативни. Тако је приказана 100% специфичност ПЦР анализе. У истом раду, са пункционом биопсијом лимфних чворова, доказана је могућност детекције М. Авиум.

Дијагноза туберкулозе женског гениталног подручја неплодности, како је познато, један је од најтежих проблема дијагнозе. Када ИСПИТИВАЊЕ ПЦР биопсије ендометријума, ендометријума аспирати течних узорака из Доуглас простор 14 (56%) од 25 пацијената испитиване лапароскопски сумња туберкулозу, добијени су позитивни резултати. Користећи микроскопију и културу микроскопа, добијени су резултати 1 и 2. Ови случајеви су такође били ПЦР-позитивни. Већина ПЦР-позитивних резултата везаних за случајеве са карактеристичним знацима туберкулозе према хистолошкој студији; мањи број - са сумом на туберкулозу према лапароскопским подацима. Само један позитиван резултат ПЦР анализе добијен је у одсуству лапароскопских података за туберкулозу.

Када се дијагностикују екстрапулмонални облици туберкулозе, клиничари често имају питање о могућности откривања патогена приликом испитивања узорака крви са ПЦР методом. Литерарни подаци указују да је откривање ДНК из туберкулозе микобактерије из узорака крви могуће са далекосежним облицима ХИВ инфекције. ДНК микобактеријске туберкулозе откривена је само са генерализованом туберкулозом различитих органа код пацијената са трансплантираним бубрезима и имуносупресијом.

[60], [61], [62], [63], [64], [65]

Идентификација врста микобактерија

Поступак ПЦР може бити веома ефикасна за брзу идентификацију микобактерија туберкулозе комплекса и неких врста микобактерија нонтуберцулар примио свој први раст. У овом случају, употреба ПЦР-а може уштедети 7-10 дана, неопходних за накнадну културну идентификацију позитивног резултата. ПЦР тест је технички врло једноставан, јер не захтева компликовану припрему узорка клиничког материјала ради постизања високе осетљивости. У студији 80 позитивне у овом тест систему (МБ Васто. Органон фирме) све позитивне културе ПЦР били су строго специфични и одржавано 1 дан. За идентификацију других врста микобактерија у припрему ДНК патогена културе хибридизује са специфичним ДНК пробама означене акридина и сојева откривају појавом хемилуминесценције преко цхемилуминометер или нитроцелулозе трака са визуелном проценом После хибридизације. Уз помоћ таквог сета идентификовани су ограничени број врста: комплекс микобактерије туберкулозе. М. Авиум, М. Авиум комплекс, М. Кансасии и М. Гордонае.

А.Теленти и сар. Такође развила релативно једноставан и јефтину методу идентификације врста клинички значајних врста микобактерија помоћу ПЦР и затим третман са два рестрикционим ензимима (ензими који пропертиес цут ДНК молекул на одређеним тачкама). ДНК фрагмент је појачан. Који кодира топлотни шок протеин (65 кДа), а затим ПЦР фрагмент 439 нуклеотидних парова произведених ПЦР-ом третира се засебно са два ензима, Бсте ИИ и Нае ИИИ. Тада анализирани уз помоћ електрофорезом на агароза гелу добијено два производа, одређивање њихове величине (број базних парова) користећи стандардни сет ДНК фрагмената (молекуларни ДНК-маркера) у дужини од 100 до 1000 базних парова. У сваком од специфичних типова (М. Туберцулосис, М. Авиум, М. Интрацеллуларе, М. Кансасии, М.фортуитум) детектовати два или три ДНК фрагмената различитих величина за сваки ензим рестрикционим. Добијена комбинација различитих величина ДНК дозвољава разлику између ових врста међу собом.

Развија се технологија биолошких ДНК микроракара. Што ће помоћи у идентификацији више од 100 врста микобактерија у једној студији.

Идентификација врсте могу обављати ПЦР амплификацијом 16С рРНК варијабилних региона праћено секвенцирањем амплицонс у поређењу са одговарајућим примарне структуре који омогућава идентификацију преко 40 врста микобактерија.

Уз помоћ ПЦР-а, идентификација врсте у оквиру комплекса мицобацтериум туберцулосис такође може бити изведена, укључујући диференцијацију М. Бовиса и М. Бовис БЦГ. Да би се то урадило, анализирано је присуство или одсуство неких гена у геномским регионима РД1. РД9 и РД10. РД1 је одсутан у М. Бовис БЦГ, али је присутан код вирулентних врста, укључујући М. Бовис.

Одређивање осетљивости лека на Мицобацтериум туберцулосис помоћу ПЦР

Циљеви молекуларних генетичким методама за подложност дрога или отпорност Мицобацтериум туберцулосис смањују идентификовати мутације у специфичним нуклеотидних секвенци познатих гена. Основне методе се заснивају на директној процхитивании (Слијед) ових секвенци након појачавања или хибридизацијом биотином обележеним ДНК фрагмената умножени током ПЦР ДНК пробама. Обе алтернативе обухватају идентификацију нуклеотидних супституција у секвенци које користе ДНК пробе довести до одсуство или непотпуним хибридизацију нитроцелулозну мембрану помоћу ензима коњугат (стрептавидин-алкална фосфатаза) - Метход липа-Риф-ТБ.

Метод за мерење флуоресценције у локално фиксиран на мицросецтионс ДНК проба је комплементарно са познатим мутацијама у регионима ПЦР умножени гена одговорних за резистенцију или осетљивости лека, зову микробиоцхипов метод. Главни алгоритам за спровођење овог истраживања је следећи. Након изоловање ДНК из клиничког узорка или културе микобактерија је потребно спроводити ПЦР амплификацију релевантних фрагмената рпоБ гена одговорног за осетљивост лека на рифампицин или катг и Инха гена који кодирају протеине Мицобацтериум су одговорни за осетљивости на изониазид. Резултати ПЦР-а се процењују електрофорезом агарозног гела, у којој се потврдјују одговарајући ДНК фрагменти жељене дужине. Затим се изводи други круг ПЦР-а да се у ДНК уведе флуоресцентна етикета. Резултати ПЦР-а поново потврђују гел електрофореза. Након тога, хибридизација је извршена (овернигхт инкубација), праћено испирањем добијени материјал на Биоцхип, што представља велики број фиксирани у чашицу лимом кратка ДНК ланаца (сонде) које су комплементарне нуклеотидне секвенце врсте Мицобацтериум туберцулосис-осетљиви на местима могућих мутација. Као и мутантним секвенцама одговорним за отпорност на лекове. Локација ДНК проба на плочи - строго дефинисане, а ниво флуоресценције посматране при хибридизације одредити резултат помоћу посебног читање уређај инсталиран. У том смислу, резултати анализе одређују се помоћу посебног рачунарског програма.

У посљедњих неколико година развијени су алтернативни методи за одређивање сензитивности лијекова микобактерије туберкулозе на бази ПЦР технологије у реалном времену, који омогућавају извођење ових студија у затвореном тесту.

На сл. 13-13 показује резултат анализе клиничких изолата Мицобацтериум туберцулосис у одређивању отпорност на рифампицин помоћу ПЦР у реалном времену: 218 - контролни узорак (осетљив на рифампицин); 93 - позитивна контрола за мутацију Сер-Трп ТЦГ-ТГГ; 4482 - позитивна контрола мутације Сер-Леу ТЦГ-ТТГ; 162-322 - експериментални узорци. Резултат израчунавања кинетичких кривих амплификације на 4 канала: канал 1: 393 - позитивна контрола за мутацију Сер-Трп ТЦГ-ТГГ; канал 2: 4482 - позитивна контрола за мутацију Сер-Леу ТЦГ-ТТГ; 162, 163, 172, 295 - експериментални узорци; канал 4: кинетичке кривуље амплификације свих узорака који учествују у експерименту. Позитивна контрола реакције појачања. Закључци: Резултати анализе открила следеће мутације које одређују отпорност на рифампицин: у узорцима 162,163,172,295 - Сер-Леу ТЦГ-ТТГ. Исти принцип коришћен је за одређивање резистентности лека на изониазид за гене катГ и инхА, што одређује најчешће мутације.

[66], [67], [68], [69], [70], [71],

Идентификација стреса микобактерије туберкулозе

Највише темељно проу метод идентификације сојева Мицобацтериум туберцулосис је техника названа ограничење дужине фрагмент Полиморфизам (РФЛП РФЛП,. Или у енглеској верзији) и који се заснива на фрагментированин (ограничење) Мицобацтериум туберцулосис ДНА ензима ПВУ ИИ и фрагменти добијени накнадно хибридизацију са одређеним специфичним секвенцама ДНА његов поновљени елемент ИС6110. Интраспецифична варијабилност се реализује због различитог броја понављања ИС6110 и њихове локације на ДНК. Као и различите удаљености између одређених тачака напада на ензимске рестрикције ензима (места ограничења) и елемента ИС6110. Ова технологија је веома компликована и дуготрајна. Након третмана са ДНК екстраховане из културе Мицобацтериум туберцулосис, гел електрофореза је изведена на ензима рестрикције, а затим пребачени ДНК фрагменти различитих дужина на нитроцелулозној мембрани, хибридизација је извршена са фрагментима ИС6110-елемента и детектована помоћу ензимске реакције. Добијени специфични образац трака карактерише ДНК специфичног сојма Мицобацтериум туберцулосис. Уз помоћ компјутерске анализе откривен је идентитет или повезаност сојева. Упркос чињеници да је РФЛП метода нај дискриминаторнија, тј. Идентификује највећи број разлика у сојева анализираних, то је неефикасан за мали број (мање од 5) ИС6110-понављања примећених код неких сојева. На сл. 13-14 показују резултате РФЛП-типкања сева.

Алтернатива може бити метод сполиготипизације - анализа полиморфизма секвенци спацер ДНК - посредовање између директних понављања региона ДР. Код спровођења сполиготипизације сева, ПЦР се изводи са прајмерима који ограничавају регион ДР, након чега се формирају фрагменти различите дужине који се хибридизују са променљивим средњим регионима ДНК. Приказана је анализа спацер секвенци региона ДР. Према истраживачима, једноставнија, продуктивнија и погодна за примарно скенирање сила и прелиминарне епидемиолошке анализе, као и истраживање директно клиничког материјала.

Очигледно је да је ефикаснији и технолошки приступачнији метод ВНТР (скраћеница енглеских ријечи) или метода за одређивање варијабли броја тачних тандем понављања у ДНК микобактерије туберкулозе. Ова метода се заснива само на употреби ПЦР-а и не захтева додатну манипулацију. Пошто је број тандемских понављања у различитим врстама и различитим локусима различит, фрагменти различитих величина су одређени и анализирани на резултујућој електрофореграму ПЦР производа. Према истраживачима, коришћење ВНТР-а постиже већи степен дискриминације сома него са РФЛП методом.

У последњих неколико година посвећена је велика пажња дистрибуцији сојума Мицобацтериум туберцулосис породице В-Беијинг (понекад се назива и пекингским сојом), који су у великој мјери отпорни на лекове.

Основни захтеви за квалитет молекуларних биолошких истраживања

[72], [73], [74], [75],

Основни регулаторни документи за ПЦР

Поруџбине Руског Министарства здравља: №45 од 02.07.2000 г .. Број 109 од 21.03.2003 г .. Број 64 од 21.02.2000, смернице: 1.3.1888-04 "Организација рада у студијама које користе ПЦР материјал заражен патогене биолошке агенси група ИИИ-ИВ патогености "; 1.3.1794-03 "Организација рада у проучавању ПЦР материјала, инфицираних микроорганизмима група И-ИИ патогености". 2003; 3.5.5.1034-01 "деконтаминације материјала, инфициране бактерије И-ИВ патогеност групе при коришћењу ПЦР," 2001 додатку 11 до јединственог упутства за микробиолошким методама испитивања у идентификовању, дијагностици и лечењу туберкулозе.

[76], [77], [78]

Особље

Извршење за молекуларну биолошких истраживања може држати лекари клиничких лабораторијске дијагностике, доктори бактериолога вирологисти, лекари, биолози, клиничке дијагностичке лабораторије, као и стручњаци са средњом медицинском образовању, донет специјализацију и усавршавање на прописан начин.

Уредјење лабораторијских просторија

Потребне су сљедеће лабораторијске собе:

• Област примене узорка је лабораторија прилагођена раду са инфективним агенсима група ИИИ-ИВ патогености, према Методичким упутствима 13.1888-04.
• Зона за припрему реакционих смеша ПЦР - лабораторијска соба, која пружа заштиту од унутрашње лабораторијске контаминације - "чиста" зона.
• • Ако се за анализу ПЦР производа користи електрофореза или хибридизација. Лабораторија Просторија у којој су умножене ДНК фрагменти екстрахован из цеви и амплификације, респективно, могу ући у околину, у складу са захтевима за ПЦР лабораторија (1.3.1794-03 смерницама, Гуиданце 1.3.1888-04) морају бити потпуно изолован из просторија наведених у претходним параграфима. Треба искључити из зоне кретања у зони електрофорезу за руковање узорцима и "чисте" површине било особља, опреме, било материјала и објеката, као и пренос ваздуха кроз вентилациони систем, или као последица промаје. Ова зона није потребна за флуориметријску детекцију ПЦР производа.
• Простор за документацију и обраду резултата опремљен је рачунарима и неопходном уредском опремом. Ова просторија може садржати опрему која омогућава откривање ПЦР производа без отварања цијеви. - флуоресцентни ПЦР детектори и термички циклуси за ПЦР у реалном времену.

Санитарни и епидемиолошки захтеви за примарну терапију спутума су слични стандардним микробиолошким захтевима за рад са туберкулозом микобактерије.

[79], [80], [81], [82],

Завршетак лабораторијске опреме за ПЦР дијагностику

Лабораторија укључује опрему за следеће просторије.

• простор за припрему узорака, садржи следећу опрему: ламинар ИИ разреда заштите "СП-1.2": чврсти термостат са поклопцем за грејање за епрувете типа "Еппендорф"; микроцентрифуга на 13.000 о / мин; центрифуга (Вортекс); фрижидер са опсегом температуре од -20 ^о С до +10 ^о С; пипете променљиве запремине серије "Рролине"; пумпа са затварачем ОМ-1; статив за пипете; радна станица статива 200к0,5 мл; стационарна радна станица 50к1.5 мл; Стојала за чување епрувета 80к1.5 мл;
• Припремна соба за реакциону смешу: заштитна комора ПЦР кутија ("Ламинар-Ц. Центрифуга - Вортек; Прометне запремине пипете серије Пролине; статив за пипете; трипод радна станица 200к0,2 мл; Стојала за чување епрувета 80к1.5 мл; фрижидер са опсегом температуре од -20 ^о С до + 10 ^о С;
• простор за електрофорезу: камера за хоризонталну електрофорезу; напајање; трансилуминатор;
• ДНК појачала или анализатор нуклеинске киселине (ПЦР у реалном времену) са рачунарима и софтвером; може се ставити у било коју резервну собу. Ако се користи ПЦР технологија у реалном времену. Простор за електрофорез није потребан.

[83], [84], [85], [86]

Екстерна контрола квалитета

Да би били сигурни у добијање објективно поузданих резултата, лабораторије треба да учествују у систему екстерне евалуације квалитета лабораторијских истраживања.

Учесници у систему контроле квалитета примају; 12 бочица бактеријских ћелија суспензија осушених замрзавањем, од којих су две садрже Е. Цоли Е. Кокосовог влакна 3 бочице са Мицобацтериум туберцулосис (сој авирулент) на 10 ² / мл; 3 ампуле са ћелијама сличног сода у концентрацији од 10 ⁴ / мл; 2 ампуле са не-туберкулозним микобактеријама М. Авиум-интрацеллуларе и М. Кансасии у концентрацији од 10 ⁵ / мл.

Дистрибуирани тестови за екстерно процењивање квалитета претходно се тестирају у две независне лабораторије са великим искуством у овој области.

[87], [88]