Улога ензима и цитокина у патогенези остеоартритиса

У последњих неколико година, велики број истраживања се фокусирао на идентификацију протеаза одговорних за деградацију ЕЦМ зглобне хрскавице у остеоартритису. Према модерним идејама, важну улогу у патогенези остеоартритиса играју матричне металопротеазе (ММП). Пацијенти са остеоартритисом имају повећан ниво од три представника ММП-коллагеназа, стромелина и желатиназа. Цоллагенасе је одговоран за деградацију нативног колагена, стромелизин - колагена типа ИВ, ламинина и протеогликане, азхелатиназа - за деградација желатина, колагена ИВ, Вх типови КСИ еластина. Поред тога, присуство још једног ензима - агреганаза, који има својства ММП и одговоран је за протеолизу хрскавих агрегата протеогликана.

Зглобне хрскавице људских колагеназе идентификовали три врсте нивоа које су повишени код пацијената са остеоартритиса - колагеназе-1 (ММП-1), колагеназе-2 (ММП-8), колагеназе-3 (ММП-13). Коегзистенција три различита типа коллагеназа у артикуларној хрскави показује да свака од њих има своју специфичну улогу. Заиста, колагеназе-1 и -2 локализовани углавном у површне и вишем средњем зони зглобне хрскавице, а колагеназе-3 се налази у дну интермедијарних и дубоким зонама. Штавише, резултати имунохисто- студије су показале да током прогресије остеоартритиса нивоа колагеназе-3 достиже плато или чак смањује, док је ниво колагеназе-1 се постепено повећава. Постоје докази да за остеоартритис колагеназе-1 је углавном укључена у инфламаторни процес у зглобне хрскавице, а колагеназе-3 - у ремоделирању ткива. Картилагин-3, изражен у хрскавици пацијената са ОА, интензивније деградира колагени типа ИИ него колагеназа-1.

Представника друге групе металопротеаза Хуман стромелизинову идентификован као три - стромелизин-1 (ММП-3), стромелизин-2 (ММП-10) и стромелизина-3 (ММП-11). Данас је познато да је само стромелин-1 укључен у патолошки процес остеоартритиса. У синовијалне мембране пацијената са остеоартритиса нису одређене стромелизина-2, али се наћи у веома малим количинама у синовијалних фибробласта пацијената са реуматоидним артритисом. Стромелизина-3, такође налази у синовије пацијената са реуматоидним артритисом код фибробласта, посебно у областима фиброзе.

У групи желатиназе у људској хрскавице препознаје само два - 92 кДа желатиназа (желатиназа Б или ММП-9) и 72 кДа желатиназа (желатиназа А или ММП-2); код пацијената са остеоартритисом утврђено је повећање нивоа 92 кД желатиназе.

Не тако давно, идентификована је још једна група ММП која су локализована на површини ћелијских мембрана и називају се ММП мембрански тип (ММП-МТ). У ову групу припадају четири ензима - ММП-МТ1-ММП-МТ-4. Израз ММП-МТ се налази у људским зглобним хрскавицама. Иако ММП-МТ-1 поседује својства коллагеназе, оба ММП-МТ-1 и ММП-МТ-2 могу активирати желатиназу-72 кД и коллагеназу-3. Улога ове групе ММП у патогенези ОА захтева прецизност.

Протеиназе се излучују у облику зимогена, који се активирају од других протеиназа или органских једињења живине. Каталитичка активност ММП зависи од присуства цинка у активној зони ензима.

Биолошку активност ММП-а контролише одређени ТИМП-ови. До данас су идентификоване три врсте ТИМП које се налазе у људским зглобним ткивима, ТИМП-1-ТИМП-3. Четврти тип ТИМП-а је идентификован и клониран, али још није откривен у људским зглобним ткивима. Ови молекули се везују специфично за активно место ММП, иако су неки од њих могу да везују активним местом 72 кДа прогелатинасе (ТИМП-2, -3, -4) и 92 кДа прогелатинасе (ТИМП-1 и -3). Подаци показују да је ОА зглобне хрскавице у дисбаланс између ММП и ТИМПс која резултира релативним недостатком инхибитора који се могу делимично везаних за повећане ММП активност у ткиву. ТИМП-1 и -2 се налазе у зглобној хрскавици, синтетишу их хондроцити. Са остеоартритисом у синовијалној мембрани и синовијалној течности откривен је само први тип ТИМП-а. ТИМП-3 се детектује искључиво у ЕЦМ-у. ТИМП-4 има приближно идентичну секвенцу аминокиселина са ТИМП-2 и-ЗИНОМ од око 38% -СТИМП-1 за скоро 50%. Остали циљне ћелије ТИМП-4 је одговоран за модулисање активације прогелатинасе 72 кД ћелијски површински, сугеришући важну улогу као регулатор ткивно специфичан ЕЦМ ремоделирање.

Још један механизам за контролу биолошке активности ММП-а је њихова физиолошка активација. Верује се да су ензими из породице серина и цистеинских протеаза, као што су АП / плазмин и катхепсин Б, физиолошки активатори ММП. Код артикулисане хрскавице пацијената са остеоартритисом откривени су повишени ниво урокиназе (УАП) и плазмин.

Упркос чињеници да се у заједничким ткивима налази неколико врста катепсина, катепсин-Б се сматра највероватнијим активатором ММП-а у хрскавици. У ткивима људског зглоба откривени су физиолошки инхибитори серина и цистеинских протеаза. Активност инхибитора АП-1 (ИАП-1), као и цистеин протеазе, смањена је код пацијената са остеоартритисом. Слично ММП / ТИМП-у, то је неравнотежа између серина и цистеинских протеаза и њихових инхибитора који могу објаснити повећану активност ММП-а у зглобној хрскавици код пацијената са остеоартритисом. Поред тога, ММП се могу активирати једни друге. На пример, стромелин-1 активира колагеназу-1, колагеназу-3 и желатиназу 92 кД; Колагеназа-3 активира 92 кД желатиназе; ММП-МТ активира колагеназу-3, а желатиназа-72 кД потенцује ову активацију; ММП-МТ такође активира 72 кД желатиназе. Цитокини се могу поделити у три групе - деструктивне (проинфламаторне), регулаторне (укључујући антиинфламаторне) и анаболичке (фактори раста).

Врсте цитокина (према ван ден Берг ВБ ет ал)

Деструктивно	Интерлейкин-1 ТНФ-а Леукемијски инхибиторни фактор Интерлейкин-17
Регулаторни	Интерлейкин-4 Интерлейкин-10 Интерлейкин-13 Инхибитори ензима
Анаболички	Мсулин-лике фактори раста ТФР-б Морфогенетски протеини костију Морфогенетски протеини произведени из хрскавице

Деструктивни цитокини, нарочито ИЛ-1 индуковану повећање ослобађање протеаза и инхибирају синтезу протеогликане и колагена Хондроцити. Регулаторна Цитокини, посебно ИЛ-4 и -10, инхибирају производњу ИЛ-1 рецептор антагониста, да повећа производњу ИЛ-1 (ИЛ-1 РА) и смањити активност ниво и НО-синтазе ин хондроцита. Стога, ИЛ-4 антагонизира ИЛ-1 на три начина: 1) смањује производњу и спречава њене ефекте, 2) повећава производњу основног "сакупљача" ИЛ-1ПА и 3) смањује производњу примарног секундарне "Мессенгер» бр. Поред тога, ИЛ-4 смањује деградацију ензимског ткива. Ин виво услови, оптимални терапеутски ефекат се постиже комбинацијом ИЛ-4 и ИЛ-10. Анаболички фактори, као што какТФР-п, а ИГФ-1, заправо не интерферирају са производњом или дејства ИЛ-1, али показује супротног активност, на пример, стимулише синтезу протеогликана и колагена, инхибирају активности протеазе и ТГФ (3, такође инхибира ослобађање ензима и стимулише њихове инхибиторе.

Проинфламаторни цитокини су одговорни за повећану синтезу и експресију ММП у зглобним ткивима. Они се синтетишу у синовијалној мембрани, а затим се дилују у зглобну хрскавицу кроз синовијалну течност. Проинфламаторни цитокини активирају хондроците, који заузврат такође могу да произведу проинфламаторне цитокине. У зглобовима погођеним остеоартрозом, улогу ефектора запаљења играју углавном ћелије синовијалне мембране. То је синовитис типа макрофага који лочи протеазе и запаљенске медијаторе. Међу њима, у патогенези остеоартритиса, у највећој мјери су укључени ИЛ-ф, ТНФ-а, ИЛ-6, инхибиторни фактор леукемије (ЛИФ) и ИЛ-17.

Биолошки активне супстанце које стимулишу честичну деградацију хрскавице у остеоартритису

• Интерлейкин-1
• Интерлейкин-3
• Интерлейкин-4
• ТНФ-а
• Фактори стимулације колонија: макрофага (моноцитна) и гранулоцитна макрофага
• Супстанца П
• ПГЕ- ₂
• Активатори плазминогена (ткива и урокиназе) и плазмин
• Металлопротеазе (коллагеназе, еластазе, стромелизини)
• Катепсини А и Б
• трилер
• Бактеријски липополисахариди
• Фосфолипаза Аг

Подаци из литературе показују да су ИЛ-ип и, могуће, ТНФ-а, главни посредници уништавања артикуларних ткива у остеоартритису. Међутим, још није познато да ли функционишу независно од њих или постоји функционална хијерархија између њих. На моделима остеоартритиса код животиња показано је да ИЛ-1 блокада ефикасно спречава уништавање зглобне хрскавице, а блокада ТНФ-алфа доводи до слабљења запаљења у заједничким ткивима. У синовијалној мембрани, синовијалној течности и хрскавици пацијената откривене су повећане концентрације оба цитокина. У хондроцити могу да повећају синтезу не само протеаза (ММП и углавном АП), већ и мање колагена, као што су тип И и ИИИ, као и смањити синтезу типова колагена ИИ и ИКС и протеогликане. Ови цитокини такође стимулишу активне врсте кисеоника и инфламаторне медијате као што је ПГЕ ₂. Резултат таквих макромолекуларних промена у зглобној хрскавици са остеоартритисом је неефикасност процеса поправки, што доводи до даље деградације хрскавице.

Наведени про-инфламаторни цитокини модулишу процесе инхибиције / активације ММП у остеоартритису. На пример, дисбаланс између нивоа ТИМП-1 и ММП у хрскавице код остеоартритиса може бити посредована ИЛ-ип, јер студија ин витро показала да повећање концентрације ИЛ-1бета смањује концентрацију ТИМП-1 и ММП повећана синтеза хондроцити. Синтеза АП је такође модулисана помоћу ИЛ-1бета. Стимулација ин витро хондроцитима зглобне хрскавице са ИЛ-1 повећањем визивет завистан од дозе код синтезе и оштром АП смањење синтезе ПАИ-1. Способност ИЛ-1 до смањи синтезу ПАИ-1 синтезу и стимулишу АП је моћан механизам за генерисање плазмина активације и ММП. Поред тога, плазмин није само ензим активирања друге ензиме, такође учествује у деградацији хрскавице директним протеолизе.

ИЛ-ип се синтетизује као неактивног прекурсор масе 31 кД (пре-ИЛ-ип), АЗАТ, након цепања сигналног пептида, се конвертује у активни цитокин из масе 17,5 кД. У ткивима зглобова, укључујући синовијалне мембране и синовијској течности зглобне хрскавице, ИЛ-ип откривена у активном облику, а у студијама ин виво показала способност синовијалне мембране код остеоартритиса излучивања Овај цитокин. Неке серинске протеазе су способне да пре-ИЛ-ип претворе у његову биоактивну форму. Код сисара, таква својства налазе само у једној протеазе, који припада фамилији цистеина аспартатспетсифицхеских ензима зове ИЛ-1п-конвертујућег ензима (ИКФ или Цаспасе-1). Овај ензим је способан да специфично претварања пред-ИЛ-ип биолошки активан "зреле" ИЛ-ип са масом од 17,5 кД. ИКФ - проензим са молекулском тежином од 45 кДа (П45), који је локализован у ћелијској мембрани. Након проензима П45 протеолитичка цепање да формирају две подјединице, познатих као п10 и П20, који је карактеристичан за ензимске активности.

ТНФ-а се такође синтетише као прекурсор који је везан за мембране масе од 26 кД; путем протеолитичког цепања, ослобађа се из ћелије као активни растворљиви облик са масом од 17 кД. Протеолитичко цепање врши ТНФ-а-конвертујући ензим (ТНФ-КФ), који припада породици адамализина. АР Амин и коаутори (1997) су пронашли повећану експресију ТНФ-ЦФ мРНК у зглобној хрскавици код пацијената са остеоартритисом.

Биолошка активација хондроцитима и синовитситов ИЛ-1 и ТНФ-а посредовано везивањем за специфичне рецепторе на ћелијској површини - ИЛ-Р и ТНФ-Р. За сваки цитокин идентификовани су две врсте рецептора: ИЛ-ИП типова И и ИИ и ТНФ-П И (п55) и ИИ (п75). За пренос сигнала у ћелијама заједничких ткива, реагују ИЛ-1ПИ и п55. ИЛ-1П тип И има нешто већи афинитет за ИЛ-1бета него за ИЛ-1а; ИЛ-1П тип ИИ - напротив, има већи афинитет за ИЛ-1а него за ИЛ-ип. Остаје нејасно да ли ИЛ-ИП ИИ тип ИИ може посредовати ИЛ-1 сигналима или служи само за конкурентно инхибирање ИЛ-1 везивања за тип ИЛ-1ПИ. У хондроиитах и синовијалним фибробласта пацијената са остеоартритиса наћи велику количину ИЛ-1ПИ и п55, што заузврат објашњава високу осетљивост ових ћелија на стимулацију цитокинима релевантним. Овај процес доводи до повећања секреције протеолитичких ензима и до уништења зглобне хрскавице.

Није искључено учешће ИЛ-6 у патолошком процесу у остеоартритису. Ова претпоставка се заснива на следећим запажањима:

• ИЛ-6 повећава број инфламаторних ћелија у синовијалној мембрани,
• ИЛ-6 стимулише пролиферацију хондроцита,
• ИЛ-6 побољшава ефекте ИЛ-1 у повећању синтезе ММП-а и инхибира синтезу протеогликана.

Међутим, ИЛ-6 је у стању да индукује продукцију ТИМП, али не утиче на производњу ММП се стога сматра да ова цитокин укључена у процес обуздавање протеолитичког деградације зглобне хрскавице, која се одвија преко механизма повратних.

Други представник ИЛ-6 фамилије је ЛИФ - цитокин који се производи хондроцити добијених од пацијената са остеоартритиса, као одговор на стимулацију про-инфламаторних цитокина ИЛ-ип и ТНФ-а. ЛИФ стимулише ресорпцију протеогликана хрскавице, као и синтезу производње ММП и НО. Улога овог цитокина код остеоартритиса није у потпуности схваћена.

ИЛ-17 је 20-30 кД хомодимер који делује ИЛ-1, али много мање изражен. ИЛ-17 стимулише синтезу и изолацију броја про-инфламаторних цитокина, укључујући ИЛ-ип, ТНФ-а, ИЛ-6 и ММП у циљним ћелијама, на пример, у људским макрофагима. Поред тога, ИЛ-17 стимулише НО производњу са хондроцитима. Као и ЛИФ, улога ИЛ-17 у патогенези ОА је мало проучавана.

Неоргански слободни радикал НО игра важну улогу у деградацији зглобне хрскавице са ОА. Хондроцити добијени од пацијената са остеоартритисом производе више НО као спонтано, као и након стимулације с проинфламаторним цитокинима у поређењу са нормалним ћелијама. Висок садржај НО се налази у синовијалној течности и серуму пацијената са остеоартритисом - резултат повећане експресије и синтезе индуковане НО синтазе (хНОЦ), ензиме одговорног за производњу НО. Недавно је клонирана ДНК хондроцитног хНОЦ-а, одређена је амино киселинска секвенца ензима. Секвенца аминокиселина указује на 50% идентитет и 70% сличност са хНОЦ специфичним за ендотел и неуронско ткиво.

НО инхибира синтезу макромолекула ЕЦМ артикуларне хрскавице и стимулише синтезу ММП. Штавише, повећање производње НО праћено је смањењем синтезе ИЛ-ИП (ИЛ-1РА) антагониста хондроцитима. Тако повећање нивоа ИЛ-1 и смањење ИЛ-1 РА доводи до хиперстимулације НО хондроцита, што доводи до повећане деградације матрице хрскавице. Постојали су извештаји о терапијском ефекту ин виво селективног хНОЦ инхибитора на прогресију експерименталног остеоартритиса.

Природни инхибитори цитокина могу директно инхибирати везивање цитокина на рецепторе ћелијских мембрана, смањујући њихову проинфламаторну активност. Природни инхибитори цитокина могу се подијелити у три класе према њиховом начину дјеловања.

Прва класа инхибитора укључују антагонисте рецептора, који спречавају везивање лиганда на рецептором конкуренцијом за везујуће место. До данас је такав инхибитор пронађен само за ИЛ-1 - ово је горе поменути компетитивни инхибитор ИЛ-1 / ИЛИП ИЛ-1 ПА система. ИЛ-1 РА блокира многе од ефеката који се посматрају у ткивима зглобова код остеоартритиса, укључујући синтезу простагландина у синовијалним ћелијама, производња колагеназе хондроцити и деградације зглобне хрскавице у кабинету.

ИЛ-1ПА се детектује у различитим облицима - један растворљив (рИЛ-1ПА) и два интерцелуларна (μИЛ-лПАИ и μИЛ-1АПАП). Афинитет растворног облика ИЛ-1РА је 5 пута већи од интерцелуларних облика. Упркос интензивном научном потрази, функција ове друге је и даље непозната. Експеримети ин витро су показале да инхибиција ИЛ-1бета активности потребне концентрације ИЛ-1ПА 10-100 пута прелази границу у условима ин виво захтева Тхоусандфолд повећање концентрације ИЛ-1ПА. Ова чињеница може дијелом објаснити релативни недостатак ИЛ-1 РА и вишак ИЛ-1 у сновији пацијената са остеоартритисом.

Друга класа природних инхибитора цитокина представљају растворљиви рецептори цитокина. Примјер таквих инхибитора код људи који су повезани са патогенезом остеоартрозе је пИЛ-1П и пп55. Растворљиви рецептори цитокина су скраћени облици нормалних рецептора, који се везују за цитокине, они ометају њихово везивање на мембране-придружене рецепторе циљних ћелија, дјелујући механизмом конкурентског антагонизма.

Главни прекурсор солубилних рецептора је мембрански везан ИЛ-1ПП. Афинитет рИЛ-ИП у односу на ИЛ-1 и ИЛ-1 ПА је различит. На пример, РИЛ-1РН има виши афинитет за ИЛ-1 п, него ИЛ-1 РА и РИЛ-1ПИ - испољава већи афинитет за ИЛ-1ПА него ИЛ-ип.

Код ТНФ-а постоје и две врсте растворљивих рецептора - пп55 и пп75, као што су растворљиви рецептори ИЛ-1, они се формирају помоћу "давања". Ин виво, оба рецептора се налазе у ткивима зглобних зглобова. Расправља се о улози солубилних ТНФ рецептора у патогенези остеоартритиса. Предлаже се да у малим концентрацијама стабилизују тродимензионалну структуру ТНФ-а и повећају полувријеме биоактивног цитокина, док високе концентрације пп55 и пп75 могу смањити активност ТНФ-а кроз конкурентски антагонизам. Очигледно, пп75 може деловати као носилац ТНФ-а, олакшавајући његово везивање за рецептор који је повезан са мембраном.

Трећа класа природних инхибитора цитокина представљена је групом антиинфламаторних цитокина, која укључују ТГФ-бета, ИЛ-4, ИЛ-10 и ИЛ-13. Антиинфламаторни цитокини смањују продуктивност про-инфламаторне, као и неке протеазе, стимулишу продукцију ИЛ-1РА и ТИМП.